Erinevused fluorestsentsmikroskoopide ja tavaliste valgusmikroskoopide vahel
Fluorestsentsmikroskoobid erinevad tavapärastest optilistest mikroskoopidest. Selle asemel, et vaadelda proove tavalise valgusallika valgusega, kasutavad nad kindla lainepikkusega valgust (tavaliselt ultraviolett- või sinakasvioletset valgust), et ergutada mikroskoobi objektiklaasil olevas proovis fluorestseeruvaid aineid, põhjustades nende ainete fluorestsentsi. Seetõttu ei valgusta fluorestsentsmikroskoobi valgusallikas proovi otseselt; see toimib energiaallikana, et ergutada proovis olevaid endogeenseid fluorestseeruvaid aineid. Me näeme proovi mitte valgusallika enda valgustuse tõttu, vaid seetõttu, et proovi sees olevad fluorestseeruvad ained neelavad ergastavat valgusenergiat ja kiirgavad seejärel fluorestsentsi.
Sellest järeldub, et fluorestsentsmikroskoobi põhiomadus on see, et selle valgusallikas suudab anda kindla lainepikkusega ergastusvalgust, võimaldades kontrollitud proovis olevatel fluorestseeruvatel ainetel eraldada piisava intensiivsusega fluorestsentsi. Samal ajal peab fluorestsentsmikroskoop olema varustatud vastava filtrisüsteemiga. See on fluorestsentshistokeemia oluline vahend. Fluorestsentsmikroskoop koosneb peamiselt ülikõrgsurve valgusallikast, filtrisüsteemist (sealhulgas ergastusfiltrid ja barjäärifiltrid), optilisest süsteemist ja fotosüsteemist. See toimib, kasutades fluorestseeruvate ainete ergutamiseks kindla lainepikkusega valgust.
① Fluorestsentsi ergastamise meetodidVastavalt ergastusvalguse lainepikkuste vahemikule on kahte tüüpi: UV-ergastusmeetod (ultraviolettvalgustuse meetod) ja BV-ergastusmeetod (sini-violetne valgustusmeetod). UV-ergastamise meetod kasutab ultraviolettkiirgust, mis on lühem kui 400 ergastus.nm. See tekitab nähtamatut fluorestsentsi, nii et täheldatud fluorestsents pärineb proovist endast. See meetod eristab kergesti spetsiifilist fluorestsentsi tausta autofluorestsentsist.
② BV ergastusmeetod BV ergastusmeetod kasutab ergastusvalgust, mis ulatub violetsest siniseni ja mille keskpunkt on 404 nm ja 434 nm. Kuna proovi kiiritamiseks kasutatakse sinist valgust, peab selle meetodi ergastusfiltrisüsteem sinise valguse täielikult blokeerima ja laskma läbi ainult vajaliku rohelise ja kollase valguse. Fluorestseeruva antikeha värvimise korral on ergastava valguse maksimaalne neeldumislainepikkus lähedane fluorestseeruva värvaine maksimaalse emissiooni lainepikkusele. Sel põhjusel peab BV ergastamiseks mõeldud filtrikomplekt kasutama tõkkefiltrit. See meetod kasutab ergastamiseks sinist valgust, seega on fluorestsentsi kogumise efektiivsus suhteliselt kõrge ja saab saada heledamaid pilte. Selle puuduseks on see, et üle 500 nm fluorestsentsi ei ole võimalik tuvastada ja üle 500 nm on näha ainult kollakasrohelisi pilte. Fluorestseeruvate antikehade värvimisel sõltub spetsiifilisuse hindamine suuresti värviteabest, seega võib BV ergastusmeetodi puudus olla peene spetsiifilisuse arutamisel peamiseks piiranguks.
