Mis on kahefotoni fluorestsentsmikroskoopia
Kahe footoni ergastuse põhiprintsiip on: suure footonitiheduse korral suudavad fluorestseeruvad molekulid neelata korraga kahte pikalainelist footoni ning pärast lühikest nn ergastatud oleku eluea perioodi kiirgavad lühema lainepikkusega footoni. . ; efekt on sama, mis fluorestseeruva molekuli ergastamiseks footoni, mille lainepikkus on pool pikast lainepikkusest. Kahe footoni ergastamiseks on vaja suurt footoni tihedust. Selleks, et rakke mitte kahjustada, kasutatakse kahe fotoni mikroskoopias suure energiaga režiimilukuga impulsslasereid. Selle laseri kiirgav laser on kõrge tippenergia ja madala keskmise energiaga, selle impulsi laius on vaid 100 femtosekundit ja selle sagedus võib ulatuda 80–100 megahertsini. Kui kasutada impulsslaseri footonite teravustamiseks suure numbrilise avaga objektiivi, on footonite tihedus objektiivi fookuspunktis suurim ja kahe footoni ergastus toimub ainult objektiivi fookuspunktis, nii et kahe fotoni mikroskoop ei vaja konfokaalset tihvti, mis parandab fluorestsentsi tuvastamise efektiivsust.
Üldiste fluorestsentsnähtuste korral võib ergastusvalguse madala footonitiheduse tõttu fluorestseeruv molekul neelata korraga ainult ühte footoni ja seejärel kiirgada läbi kiirgussiirde fluorestseeruva footoni, mis on ühe footoni fluorestsents. Fluorestsentsi ergastusprotsessis, kus valgusallikana kasutatakse laserit, võib tekkida kahe- või isegi mitmefotoniline fluorestsents. Sel ajal on kasutatava ergastava valgusallika intensiivsus kõrge ja footonite tihedus vastab kahte footonit korraga neelavate fluorestseeruvate molekulide nõuetele. Üldlaseri kasutamisel ergastava valgusallikana ei piisa footoni tihedusest ikkagi kahe footoni neeldumise nähtuse tekitamiseks. Tavaliselt kasutatakse femtosekundilist impulsslaserit, mille hetkeline võimsus võib ulatuda megavatini. Seetõttu on kahe footoni fluorestsentsi lainepikkus lühem kui ergastusvalguse lainepikkus, mis on samaväärne ergastuse poolt tekitatava efektiga poole ergastuslainepikkuse juures.
