Erinevus (kahe footoni, konfokaalse) fluorestsentsmikroskoobi ja tavalise mikroskoobi vahel
Kahe footoni ergastamise aluspõhimõte on see, et kõrge footoni tiheduse korral võivad fluorestsentsmolekulid samaaegselt imenduda kahte pika lainepikkusega footonit ja kiirgada lühemat lainepikkust footonit pärast lühikest perioodi nn ergastatud oleku eluiga; Efekt on sama, mis footoni kasutamine pika lainepikkusega poole lainepikkusega, et ergutada fluorestsentsmolekule. Kaks footoni ergastust nõuavad kõrge footoni tihedust ja kahjustavate rakkude vältimiseks kasutab kahe footoni mikroskoopia suure energiaga režiimi lukustatud impulsslasereid. Selle laseriga eraldatud laseril on kõrge tipp ja madal keskmine energia, impulsi laius on ainult 100 femtosekundit ja sagedus kuni 80–100 megaherz. Kui kasutate suure numbrilise ava objektiivi impulsslaseri footonete fookustamiseks, on footoni tihedus objektiivi fookuspunktis kõrgeim ja kahe footoni ergastus toimub ainult objektiivi fookuspunktis. Seetõttu ei vaja kahe footoni mikroskoop konfokaalset näpunäidet, mis parandab fluorestsentsi tuvastamise tõhusust.
Üldiselt suudab fluorestsentse valguse madala footoni tiheduse tõttu fluorestsentsmolekul korraga neelata ainult ühte footonit ja kiirgada seejärel radiatiivse ülemineku kaudu ainult ühte fluorestsentsi footonit, mida tuntakse ühe footoni fluorestsentsi kaudu. Fluorestsentsi ergutusprotsesside jaoks, mis kasutavad heledate allikatena lasereid, võib tekkida kahe footoni või isegi mitmefotoonse fluorestsentsi nähtused. Sel juhul on kasutatud ergutusvalgusallikal kõrge intensiivsusega ja footoni tihedus, mis vastab fluorestsentsmolekulide nõudele, et kaks footonit samaaegselt neelata. Ergastusvalgusallikana üldise laserina kasutamise protsessis ei ole footoni tihedus kahefotoni neeldumise nähtuse tekitamiseks endiselt piisav. Tavaliselt kasutatakse femtosekundilisi impulsslasereid, hetkeline võimsus jõuab megavati tasemele. Seetõttu on kahe footoni fluorestsentsi lainepikkus lühem kui ergastusvalgus, mis on samaväärne mõjuga, mida põhjustab pool ergastuslainepikkust ergastus.
Konfokaalse fluorestsentsmikroskoopiaga seotud teadmised
Konfokaalse fluorestsentsmikroskoopia aluspõhimõte on proovi kiiritamiseks punktvalgusallikas, moodustades fookustasapinnale täpselt määratletud väikese valguse. Sellest kohast pärast kiiritamist eralduv fluorestsents kogutakse objektiivi abil ja saadetakse tagasi algsest kiiritamisviisist dihroilisest peeglist koosneva tala splitterini. Spektromeeter saadab fluorestsentsi otse detektorile. Nii valgusallika kui ka detektori ees on nööbiauk, mida nimetatakse vastavalt valgustusauguks ja tuvastamise auguks. Nende kahe geomeetrilised mõõtmed on ühtlased, umbes 100-200 nm; Võrreldes fookustasapinna valgusepunktiga, on need kaks konjugeeritud, mis tähendab, et kerge laik läbib läätsede sarja ja suudab lõpuks keskenduda nii valgustusaukule kui ka avaaugule samaaegselt. Sel moel võib fookustasapinna valgus ühtlustuda tuvastusava vahemikus, samal ajal kui fookustasapinna ülaosast või all on hajutatud valgus tuvastusauku väljapoole ja seda ei saa imiveerida. Skaneerides proovipunktiga laser abil, saab fotomajanduslik toru pärast pin -augu tuvastamist ka vastava konfokaalse pildi punktist, teisendab selle digitaalseks signaaliks ja edastab selle arvutisse ning koondab selle lõpuks ekraanil oleva kogu fookusatasapinna selgeks konfokaalseks kujutiseks.
