Värvimistehnikad ja mikroorganismide mikroskoopiline vaatlus
1. Eesmärk
1.1 Õppige mikroobse äigepreparaadi ja värvimise põhitehnikaid.
1.2 Õppige lihtsat bakterite värvimismeetodit.
1.3 Eelnevalt mõistma bakterite morfoloogilisi omadusi ning kinnistama teadmisi õliläätsede kasutamise ja aseptiliste töövõtete kohta.
2 Põhimõtted
Bakterite määrimine ja värvimine on mikrobioloogiliste katsete põhitehnika. Bakterirakud on väikesed ja läbipaistvad, mistõttu on neid tavalise valgusmikroskoobi all raske tuvastada; need peavad olema värvitud. Bakterite värvimiseks kasutatakse ühte värvi, nii et määrdunud bakterid moodustavad taustast selge värvierinevuse, nii et nende morfoloogia ja struktuur on selgemini jälgitavad. Seda meetodit on lihtne kasutada ja see sobib bakterirakkude üldise kuju ja bakterite paigutuse jälgimiseks. Lihtsa värvimise jaoks kasutatakse tavaliselt põhivärve. Seda seetõttu, et neutraalsetes, leeliselistes või nõrgalt happelistes lahustes on bakterirakud tavaliselt negatiivselt laetud ja aluseliste värvainete ioniseerimisel on nende molekulide värviv osa positiivselt laetud, seega on need aluselised. Värvaine värvimisosa ühendub kergesti bakteritega, et neid värvida. Värvunud bakterirakud on taustaga teravalt kontrastsed, mistõttu on neid mikroskoobi all lihtsam tuvastada. Lihtsa värvimise jaoks tavaliselt kasutatavate värvainete hulka kuuluvad metüleensinine, kristallviolett, aluseline fukssiin jne. Kui bakterid lagundavad suhkruid ja toodavad hapet, mis põhjustab söötme pH languse, suureneb bakterite positiivne laeng. Sel ajal võib värvimiseks kasutada happelisi värvaineid, nagu eosiin, happeline fuksia või kongopunane. Bakterid tuleb enne värvimist fikseerida. Sellel on kaks eesmärki: üks on tappa baktereid ja panna need klaasklaasile kleepuma; teine on suurendada nende afiinsust värvainete suhtes. Kaks sagedamini kasutatavat meetodit on kuumutamine ja keemiline fikseerimine. Kinnitamisel püüdke säilitada lahtrite esialgne kuju.
3 materjali
3.1 Bakterid: Bacillus subtilis 12-18h toitaineagari kaldkultuur, Staphylococcus aureus 24h toitaineagari kaldkultuur, Escherichia coli 24h toitaineagari kaldkultuur, pagaripärmi agari kaldkultuur.
3.2 Värvaine: Lu leeliseline metüleensinine värv (või ammooniumoksalaadi kristallvioletne värv), karboolhappe fuksiavärv.
3.3 Instrumendid või muud riistad: mikroskoop, alkoholilamp, objektiklaas, inokulatsioonisilmus, objektiklaasi rest, kahekihiline pudel (sisaldab seedriõli ja ksüleeni), läätsekude, füsioloogiline soolalahus või destilleeritud vesi jne.
4. Protsess: määrimine → kuivatamine → fikseerimine → värvimine → pesemine → kuivatamine → mikroskoopiline uurimine.
5 sammu
5.1 Määrimine: võtke kaks puhast ja õlivaba klaasklaasi. Steriilsetes tingimustes tilgutage väike tilk tavalist soolalahust (või destilleeritud vett) igale slaidiklaasi keskele. Kasutage Bacillus subtilis'e bakterite steriliseerimiseks inokulatsioonisilmust. , Micrococcus luteus ja Escherichia coli, korjake kaldpinnal olevatesse veepiiskadesse veidi bakteriaalset muru, segage hästi ja kandke õhukeseks kileks. Kui kasutate bakterisuspensiooni (või vedelkultuuri) määret, võite kasutada inokuleerimissilmust, et valida 2–3 silmust ja kanda need otse slaidile. Olge ettevaatlik, et te ei tilguks liiga palju füsioloogilist soolalahust (destilleeritud vett) ja eemaldage bakterid ning kandke seda ühtlaselt ja mitte liiga paksult.
5.2 Kuivatamine Kuivatage loomulikult toatemperatuuril. Kuivatamiseks võite seda ka veidi kuumutada alkoholilambi kohal, kaetud pool ülespoole. Kuid ärge sattuge leegile liiga lähedale, kuna liiga kõrge temperatuur hävitab bakterite morfoloogia.
5.3 Fikseerimine Kui kasutatakse kuumutatud kuivatamist, ühendatakse fikseerimine ja kuivatamine üheks etapiks ning meetod on sama, mis kuivatamisel. Määrige, kuivatage ja kinnitage kuumusega.
5.4 Värvimine: Asetage alusklaas tasaselt slaidiriiulile ja lisage määrdile 1 kuni 2 tilka värvilahust (värvilahus peaks lihtsalt katma määrdekile). Värvige Lu aluselise metüleensinisega 1 kuni 2 minutit ja värvige karboolhappe fukssiiniga (või ammooniumoksalaadi kristallvioletiga) umbes 1 minut.
5.5 Pesemine veega: Valage värvilahus maha ja loputage õrnalt kraaniveega slaidi ühest otsast, kuni määrdumist alla voolav vesi on värvitu. Veega pestes ärge peske kaetud pinda otse veega. Veevool ei tohiks olla liiga kiire ega liiga suur, et vältida määrdekile mahakukkumist.
5.6 Kuivatamine: Raputage slaidil olevad veepiisad maha ja kuivatage loomulikult, kuivatage fööniga või image see imava paberiga (olge ettevaatlik, et mitte baktereid maha pühkida). 5.7 Mikroskoopiline uurimine Pärast äigepreparaadi kuivamist viige läbi mikroskoopiline uuring. Enne õliläätsega vaatamist peab määrd olema täiesti kuiv.
6 Tulemused Joonistage E. coli ja Micrococcus luteuse morfoloogia, mida täheldati pärast ühekordset värvimist.
