Teadmised kahe{0}}fotoonfluorestsentsmikroskoopia kohta
Kahe{0}}footoni ergastuse põhiprintsiip on see, et suure footonitiheduse korral suudavad fluorestseeruvad molekulid üheaegselt neelata kahte pika lainepikkusega footoni ja kiirata lühema lainepikkusega footoni pärast lühikest -nn ergastatud oleku eluiga; Efekt on sama, kui kasutada fluorestseeruvate molekulide ergastamiseks footoni, mille lainepikkus on poole väiksem kui pika lainepikkus. Kahe footoni ergastamiseks on vaja suurt footonitihedust ja rakkude kahjustamise vältimiseks kasutatakse kahe-footoni mikroskoopias suure-energia režiimiga{5}}lukustatud impulsslasereid. Selle laseri kiiratav laser on kõrge tippenergia ja madala keskmise energiaga, impulsi laius on vaid 100 femtosekundit ja sagedus kuni 80–100 megahertsi. Kui kasutate impulsslaseri footonite teravustamiseks suure arvulise avaga objektiivi, on footonite tihedus objektiivi fookuspunktis suurim ja kahe{11}}fotoni ergastus toimub ainult objektiivi fookuspunktis. Seetõttu ei vaja kahe{13}}fotoni mikroskoop konfokaalset ava, mis parandab fluorestsentsi tuvastamise tõhusust.
Üldiste fluorestsentsnähtuste korral võib ergastusvalguse madala footonitiheduse tõttu fluorestseeruv molekul neelata korraga ainult ühe footoni ja seejärel kiirgada läbi kiirgussiirde teise fluorestseeruva footoni, mida tuntakse ühe footoni fluorestsentsina. Fluorestsentsi ergastusprotsesside puhul, mis kasutavad valgusallikana lasereid, võivad ilmneda kahe-fotoni või isegi mitme fotoni fluorestsentsi nähtused. Sel juhul on kasutataval ergastusvalgusallikal kõrge intensiivsus ja fotonitihedus, mis vastab fluorestseeruvate molekulide nõudele, et neelavad kaks footoni samaaegselt. Üldlaseri kasutamisel ergastava valgusallikana on footoni tihedus endiselt ebapiisav kahe-fotoni neeldumise nähtuse tekitamiseks. Tavaliselt kasutatakse femtosekundilisi impulsslasereid, mille hetkeline võimsus ulatub megavatise tasemeni. Seetõttu on kahe-fotoni fluorestsentsi lainepikkus lühem kui ergastava valguse lainepikkus, mis on samaväärne poole ergastuse lainepikkuse ergastuse tekitatava efektiga.
