Kuidas valida endale sobiv konfokaalne mikroskoop? Kas on mingi konkreetne meetod?
Konfokaalsel mikroskoopial on rohkem eeliseid kui laivälja mikroskoopial. Konfokaalne mikroskoopia võib teha proovide pidevat optilist lõikamist ja välistada signaali häired mittefokaaltasanditelt. Sel põhjusel on konfokaalse mikroskoopia kasutamine tõepoolest levinum. Siiski on turul üha rohkem konfokaalseid mikroskoope. Kuidas valida?
Konfokaalsel mikroskoopial on rohkem eeliseid kui laivälja mikroskoopial. Konfokaalne mikroskoopia võib teha proovidest pidevaid optilisi lõike ja välistada signaali häired mittefokaaltasanditelt. Sel põhjusel on konfokaalne mikroskoopia tõepoolest levinum. Siiski on turul üha rohkem konfokaalseid mikroskoope. Kuidas valida? Konfokaalse mikroskoobi valimisel on kaks peamist ja olulist kaalutlust: proovi tüüp, mida soovite uurida (nt fikseeritud või elusrakud) ja analüüsi tüüp, mida soovite läbi viia (nt staatilised või dünaamilised rakuprotsessid).
Fikseeritud rakkude konfokaalne kujutis
Fikseeritud ja värvitud rakkude või kudede pildistamiseks valime tavaliselt konfokaalse laserskaneerimise (LSCM). Selle põhjuseks on peamiselt asjaolu, et fikseeritud surnud rakkudel puuduvad elusrakkudes kiired bioloogilised sündmused ja nad saavad paremini kasu LSCM-i suuremast ruumilisest eraldusvõimest. LSCM-i kujutise eesmärk on proovi optiline viilutamine laseriga ja skaneerimiskiirus (olenevalt skaneerimismassiivi peegli kiirusest) on üldiselt 1 kaadrit sekundis. Pikemad säriajad tähendavad suuremat fotopleegitamise ohtu, kuid fikseeritud surnud rakkude puhul ei ole aeg kriitiline ja saame selle keskmistada mitme pildi tegemisega.
Elusrakkude konfokaalne pildistamine
Elusrakkude pildistamine nõuab täiendavat kaitset ebasõbraliku keskkonna eest. Kujutise tegemisel on meie esimene kaalutlus rakkude elujõulisuse ja tervise säilitamine. Konstantse temperatuuriga kütteelemendid ja perfusioonisüsteemid on olulised, eriti aeglustatud uuringute puhul. Enamik inimesi soovib uurida kiireid biokeemilisi sündmusi, mis kontrollivad elusrakkude füsioloogilist seisundit, kuid need sündmused on tavapärase LSCM-i jaoks liiga kiired. Lisaks põhjustas pikaajaline kokkupuude LSCM-iga rakkudele toksilisi valguskahjustusi. Seetõttu on elusrakkude pildistamiseks vaja spetsiaalseid konfokaalseid mikroskoope.
Elusrakkude konfokaalseks pildistamiseks on üldiselt kaks võimalust: kiirskaneerivad laserskaneerivad konfokaalsed ja pöörlevad ketta konfokaalsed kujutised. Kiire skaneerimisega konfokaalne mikroskoopia asendab aeglasemad galvanomeetripeeglid kiiremate resonantspeeglitega, võimaldades skaneerimiskiirust kuni 30 kaadrit sekundis; Kuigi spinning disk confokaalide (SDCM) eeliseks on kiirem skaneerimine (kuigi paratamatult ruumilise eraldusvõimega), võib selle kiirus teoreetiliselt ulatuda 2000 kaadrit sekundis (praktikas piiravad seda sageli muud tegurid).
Kui olete mures fotovalgenduse või väga nõrga fluorestsentssignaali pärast, võib SDCM olla sobivam. SDCM kasutab ergastava valguse hajutamiseks kahte pöörlevat ketast, millel on järjestatud mikrosüvendid. Erinevalt LSCM-ist, mis skannib proovi kohta, omandab SDCM korraga mitu kohta (umbes 100 pikslit), seega suureneb kiirus oluliselt ning SDCM-i fotopleegitamine ja väiksem fototoksilisus. Siiski saate skannimiskiiruse suurendamiseks kasutada ka kiirskaneerivaid konfokaalseid seadmeid koos ülitundlike detektoritega ja ergastava valgusenergia vähendamisega, et vähendada fototoksilisust, mis võib säilitada traditsiooniliste konfokaalsete seadmete rikkalikke funktsioone.
Automaatne konfokaalne pildistamissüsteem
Mõnele teadlasele meeldib leida viise, kuidas mikroskoopi oma individuaalsetele vajadustele vastavaks muuta. Ja mõnda teadlast isegi ei huvita, kuidas mikroskoobid tegelikult töötavad. Viimaste jaoks võib automatiseeritud konfokaalne mikroskoop neile rohkem meeldida. Näiteks Olympus FluoViewFV10i on selline täisautomaatne lauaarvuti 4-laserkonfokaalne mikroskoop. Selle kompaktne integreeritud struktuur ei vaja peaaegu üldse paigaldusruumi. Seda tüüpi instrumendid sobivad ideaalselt teadlastele, kes peavad iga päev tegema palju pildiandmeid, kuid loomulikult ei peegelda need täielikult traditsiooniliste konfokaalide funktsionaalsust ja paindlikkust. Lisaks on NikonA1 ka täisautomaatne konfokaalsüsteem. Nagu enamik tavalisi konfokaalseid skaneerimismikroskoope, kasutab ka NikonA1 galvanomeetri skaneerimispead, mille eraldusvõime on kõrgem kui hübriidskannimispeaga A1R, kuid veidi aeglasem kiirus (A1R ~30 kaadrit sekundis)
