Fluorestsentsmikroskoopide ja tavaliste optiliste mikroskoopide erinevused ja omadused
Fluorestsentsmikroskoop erineb tavalisest optilisest mikroskoobist selle poolest, et see ei jälgi proove tavaliste valgusallikate valguses. Selle asemel kasutab see teatud valguse lainepikkust (tavaliselt ultraviolettvalgust, sinililla valgust), et ergutada mikroskoobi all olevas proovis olevaid fluorestseeruvaid aineid, põhjustades nende fluorestsentsi. Seetõttu ei ole valgusallika roll fluorestsentsmikroskoobis otsene valgustus, vaid energiaallikas proovi sees olevate fluorestseeruvate ainete ergutamiseks. Põhjus, miks me saame proove vaadelda, ei ole tingitud valgusallika valgustusest, vaid fluorestsentsnähtusest, mida näitavad proovi sees olevad fluorestseeruvad ained pärast ergastatud valgusenergia neelamist. Sellest on näha, et fluorestsentsmikroskoopia tunnuseks on peamiselt see, et selle valgusallikas suudab anda suures koguses ergastusvalgust kindlas lainepikkuste vahemikus, nii et proovis olevad fluorestseeruvad ained suudavad saada vajaliku ergastusvalguse intensiivsusega. Samal ajal peavad fluorestsentsmikroskoopidel olema vastavad filtrisüsteemid. Fluorestsentsmikroskoop on fluorestsentskoe keemia põhitööriist. See koosneb põhikomponentidest, nagu ülikõrgepingeline valgusallikas, filtrisüsteem (sealhulgas ergastus- ja summutusfiltriplaadid), optiline süsteem ja fotograafiasüsteem. See kasutab proovi ergutamiseks ja fluorestsentsi kiirgamiseks teatud lainepikkusega valgust.
1. Fluorestsentsi ergastamise meetodid: Valguse lainepikkuste vahemiku järgi on kahte tüüpi: UV-ergastusmeetod (kasutades ultraviolettvalgustust) ja BV-ergastusmeetod (kasutades sinist violetset valgust). UV-ergastamise meetod kasutab ergastamiseks lühemat kui 400 nm ultraviolettvalgust. Sellel meetodil ei ole nähtavat ergastusvalgust, nii et vaadeldud fluorestsents näitab värvainele omast fluorestsentsi, mistõttu on lihtne eristada proovi spetsiifilist fluorestsentsi taustkoe isefluorestsentsist.
2. BV ergastusmeetod: see hõlmab ergastamist ultraviolettkiirgusest sinise valguseni, mille keskpunkt on 404 nm ja 434 nm. See meetod kasutab proovi kiiritamiseks sinist valgust, seega peab fluorestsentsvaatlussüsteemi väljalõigatud-filter kasutama filtrit, mis suudab täielikult blokeerida sinise valguse ja läbida täielikult vajaliku rohelise ja kollase fluorestsentsi. Fluorestseeruvate antikehade meetodil kasutatavad fluorestseeruvad pigmendid. Ergastusvalguse maksimaalne neeldumislainepikkus ja fluorestsentsi maksimaalne emissioonilainepikkus on suhteliselt lähedased, seega peab BV ergastusmeetodis kasutatav filter kasutama terava lõikega filtrit. Selle meetodi abil saab ergastusvalgusena kasutada sinist valgust, nii et fluorestseeruvate pigmentide neeldumistõhusus on kõrge ja saab saada heledamaid pilte. Puuduseks on see, et fluorestsentsi lainepikkusel alla 500 nm ei ole näha, samas kui fluorestsents üle 500 nm muudab kogu pildi kollaseks. Fluorestseeruva antikeha meetodi puhul määrab spetsiifilisuse enamasti fluorestseeruvatele pigmentidele omane värv, nii et peenspetsiifilisusest rääkides on ülalmainitud BV ergastusmeetodi puudustel sageli oluline mõju.
