Mikroorganismide arvukuse määramine - mikroskoobi otseloendamise meetod!
Bakterite populatsiooni kasv väljendub rakkude arvu suurenemises või raku massi suurenemises. Rakkude arvu määramise meetodid hõlmavad otsest mikroskoobi loendamise meetodit, plaatide kolooniate loendamise meetodit, fotoelektrilise õli suhte meetodit, maksimaalse tõenäosuse meetodit ja membraanfiltratsiooni meetodit. Rakuaine mõõtmise meetodid hõlmavad rakkude kuivmassi määramist, teatud rakukomponentide nagu lämmastiku, RNA ja DNA sisalduse määramist ning metaboliitide määramist. Lühidalt öeldes on mikroorganismide kasvu mõõtmiseks palju meetodeid, millest igaühel on oma eelised ja puudused ning need tuleks valida vastavalt konkreetsele olukorrale. See katse tutvustab peamiselt tootmises ja teadusuuringutes tavaliselt kasutatavat mikroskoobi otseloendamise meetodit.
1. Eesmärgi nõuded
1. Selgitage vererakkude arvu põhimõtet.
2. Omandage mikroorganismide loendamise meetod vererakkude loenduri abil.
2. Põhiprintsiibid
Mikroskoobiga otseloendamise meetod on lihtne, kiire ja intuitiivne meetod väikese koguse testitava proovi suspensiooni vahetuks loendamiseks spetsiaalsel kindla pindala ja mahuga alusklaasil (tuntud ka kui bakteriloendur). meetodid. Praegu on kodu- ja välismaal levinumad bakteriloendurid: vererakkude loenduslaud, Peteroff-Hauseri bakteriloendur ja Hawksley bakteriloendur jne. Neid saab kasutada pärmseente, bakterite, hallitusseente eoste ja muude suspensioonide loendamiseks ning põhiprintsiip on sama. Kaht viimast tüüpi bakteriloendurite kogumaht on pärast katteklaasiga katmist 0.02 mm3 ning katteklaasi ja slaidi vaheline kaugus on vaid 0,02 mm, seega õli immersioonobjektiivi saab kasutada väikeste rakkude, näiteks bakterite, jälgimiseks. loendama. Lisaks nendele bakteriomeetritele on olemas ka määrdumise pindala ja otse mikroskoobi all vaadeldava nägemisvälja pindala suhte hindamismeetod, mida üldiselt kasutatakse piima bakterioloogiliseks uurimiseks. Mikroskoobi otseloendusmeetodi eelised on intuitiivsed, kiired ja hõlpsasti kasutatavad. Selle meetodi puuduseks on aga see, et mõõdetud tulemuseks on tavaliselt surnud ja elusate rakkude summa. Praegu on selle puuduse ületamiseks mõned meetodid, näiteks elujõuliste bakterite kombineerimine, mis värvivad mikrokambrikultuuri (lühiajaline) ja rakkude jagunemise inhibiitorite lisamine, et saavutada ainult elujõuliste bakterite loendamise eesmärk.
Selles katses kasutati otsese mikroskoopilise loendamise näitena hemotsütomeetrit. Ülejäänud kahte tüüpi bakteriloendurite kasutamise kohta vaadake iga tootja juhiseid. Mikroskoobi all loendamine hemotsütomeetriga on tavaliselt kasutatav meetod mikroorganismide loendamiseks. Loendusplaat on spetsiaalne klaasist liug, millel on neli pesa moodustatud kolm platvormi; keskel asuv laiem platvorm on lühikese põikpiluga jagatud kaheks pooleks ning platvormi mõlemal küljel on võre. Iga ruudustik on jagatud üheksaks suureks ruuduks ja keskel asuv suur ruut on loendusruum. Vererakkude loendusplaadi struktuur on näidatud joonisel l{{{{10}}}}. Loendusruumi skaalal on üldiselt kaks spetsifikatsiooni, üks on suur ruut, mis on jagatud 25 keskmiseks ruuduks ja iga keskmine ruut on jagatud 16 väikeseks ruuduks (joonis 15-2); teine on suur ruut. Ruut on jagatud 16 keskmiseks ruuduks ja iga keskmine ruut on jagatud 25 väikeseks ruuduks, kuid olenemata sellest, milline loenduslaud on, on igas suures ruudus 400 väikest ruutu. Iga suure ruudu külje pikkus on 1 mm ja iga suure ruudu pindala on 1 mm2. Peale katteklaasiga katmist on katteklaasi ja liugklaasi vaheline kõrgus 0,1mm, seega on loenduskambri maht 0,lmm3 (tuhandik milliliitrit). Joonis 15-1 Vererakkude loendusplaadi struktuur (1) Joonis 15-2 Vererakkude loenduslaua struktuur (2) A. Eestvaade; B. Pikilõike vaade; Suurendatud ruudustik, suur ruut keskel on loenduskamber 1. Vererakkude loendusplaat; 2. Katteklaas; 3. Loendamiskambris loendades arvutage tavaliselt bakterite koguarv viies ruudus, seejärel arvutage iga ruudu keskmine ja korrutage 25 või 16-ga, et saada. Seejärel teisendatakse bakterite koguarv suures ruudus bakterite koguarv 1 ml bakterilahuses. Olgu viie ruudu bakterite koguarv A ja bakterilahuse lahjendussuhe B. Kui tegemist on 25 ruuduga loendusplaadiga, siis bakterite koguarv 1 ml bakterilahuses {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(tükid) Samamoodi, kui tegemist on 16 keskmise ruuduga loendusplaadiga, siis bakterite koguarv 1 ml bakterilahuses=A/ 5×16×104×B=32000A·B (tükki)
3. Varustus
1. Bakterid
Saccharomyces cerevisiae
2. Instrumendid või muud riistad
Hemotsütomeeter, mikroskoop, katteklaas, steriilne kapillaartilguti.
4. Toimingu sammud
1. Bakterisuspensiooni valmistamine
Saccharomyces cerevisiae valmistati sobiva kontsentratsiooniga bakterisuspensiooniks steriilse füsioloogilise soolalahusega.
2. Mikroskoobi loendusruum
Enne proovide lisamist kontrollige mikroskoopiliselt loendusplaadi loenduskambrit. Kui seal on mustust, tuleb see enne loendamist puhastada ja kuivatada.
3. Lisage proov
Katke puhas ja kuiv hemotsütomeeter katteklaasiga ning seejärel tilgutage steriilse kapillaartilgutiga katteklaasi servast väike tilk raputatud Saccharomyces cerevisiae suspensiooni ja laske bakterilahusel kapillaarosmoosi abil automaatselt mööda pilu liikuda. Loendusruumi sisenedes saab üldloendusruumi täita bakterivedelikuga. Proovi võtmisel raputage esmalt bakterilahust; proovide lisamisel ei tohiks loenduskambris tekkida õhumulle.
4. Mikroskoobi loendamine
Pärast proovi lisamist seiske 5 minutit, seejärel asetage hemotsütomeeter mikroskoobi staadiumile, leidke esmalt väikese võimsusega mikroskoobiga loenduskambri asukoht ja seejärel lülitage loendamiseks suure võimsusega mikroskoobile. Reguleerige mikroskoobi valguse intensiivsust sobivalt. Valgustamiseks peegleid kasutavate mikroskoopide puhul pöörake tähelepanu sellele, et te ei kalduks valguse ühelt küljelt kõrvale, vastasel juhul ei ole loendusruumi ruudukujulisi jooni lihtne vaateväljas selgelt näha või ainult vertikaalsed või horisontaalsed jooned. Nähtud. Kui leitakse, et bakterilahus on enne loendamist liiga kontsentreeritud või liiga lahjendatud, tuleb enne loendamist lahjendus uuesti reguleerida. Üldiselt nõuab proovi lahjendamine umbes 5–10 bakterit igas väikeses rakus. Iga loenduskamber valib loendamiseks 5 keskmist lahtrit (valikuline 4 nurka ja üks keskmine kamber keskel). Ruudustiku real paiknevaid lahtreid arvestatakse üldjuhul ainult ülemisel ja paremal real. Pärmseene tärkamise korral, kui punga suurus ulatub poole emarakust, loetakse see kaheks bakterirakuks. Proovi loendamiseks arvutage proovi bakterite sisaldus, arvutades kahe loenduskambri keskmise väärtuse.
5. Peske vererakkude arv
Pärast kasutamist loputage vererakkude loenduslaud veega kraanist, ärge nühkige kõvade esemetega ning kuivatage pärast pesemist ise või fööniga. Mikroskoopiline uuring, et jälgida, kas igas väikeses rakus on jääkbaktereid või muid setteid. Kui see pole puhas, tuleb seda korduvalt pesta, kuni see on puhas.
