Fluorestsentsmikroskoopide ja tavapäraste optiliste mikroskoopide võrdlus ja omadused
Fluorestsentsmikroskoop erineb tavalisest optilisest mikroskoobist. Selle asemel, et vaadelda proove tavapärase valgusallika valgustuse all, kasutab see konkreetse lainepikkusega valgust (tavaliselt ultraviolett- või sinakasvioletset valgust), et ergutada proovis fluorestseeruvaid aineid, põhjustades nende fluorestsentsi. Seetõttu ei kasutata fluorestsentsmikroskoobi valgusallikat otseseks valgustamiseks; see toimib energiaallikana endogeensete fluorestseeruvate ainete ergutamiseks proovis. Me saame vaadelda proovi mitte allikast lähtuva valguse tõttu, vaid fluorestsentsi tõttu, mida proovis olevad fluorestseeruvad ained pärast ergastusvalguse neelamist kiirgavad.
Sellest järeldub, et fluorestsentsmikroskoobi põhiomadus on selle valgusallikas, mis suudab anda kindlas lainepikkuste vahemikus rohkesti ergastusvalgust, et tagada katsekehas olevate fluorestseeruvate ainete jaoks piisav ergastuse intensiivsus. Samal ajal peab fluorestsentsmikroskoop olema varustatud vastava filtrisüsteemiga. Fluorestsentshistokeemia olulise tööriistana koosneb see peamiselt ülikõrgsurve valgusallikast, filtrikomplektist (sh ergastusfiltrid ja barjäärifiltrid), optilisest süsteemist ja fotosüsteemist. See töötab teatud lainepikkusega valgusega proovide erutamisega, et tekitada fluorestsentsi.
Fluorestsentsi ergastusmeetodid: klassifitseeritakse lainepikkuse vahemiku järgi UV-ergastuseks (ultraviolettvalgustuse meetod) ja BV-ergastuseks (sini-violetse valguse meetod). UV-ergastamisel kasutatakse ergastamiseks peaaegu ultraviolettvalgust, mis on lühem kui 400 nm. Nähtav ergastusvalgus ei ole kaasatud, seega näitab vaadeldav fluorestsents värvainele omast fluorestsentsi. Nii on lihtne eristada proovi spetsiifilist fluorestsentsi taustkoe autofluorestsentsist.
BV ergastusmeetod: ergastamine viiakse läbi ultraviolettvalgusest sinise valguseni, mille keskpunkt on 404 nm ja 434 nm. Kuna selle meetodi puhul kiiritab proovi sinine valgus, peab fluorestsentsvaatlussüsteemi piirfilter sinise valguse täielikult blokeerima, edastades samal ajal täielikult vajaliku rohelise ja kollase fluorestsentsi. Seda meetodit rakendatakse fluorestseeruvate antikehade tehnikates kasutatavate fluorokroomide puhul. Ergastusvalguse maksimaalne neeldumislainepikkus ja fluorestsentsi maksimaalne emissioonilainepikkus on suhteliselt lähedased, seega on BV ergastuse jaoks vaja terava lõikega filtreid. Ergastusvalgusena kasutatakse siin sinist valgust, mis toob kaasa fluorokroomide kõrge neeldumise ja eredamad pildid. Selle puuduseks on see, et alla 500 nm fluorestsentsi ei ole võimalik tuvastada ja üle 500 nm signaalid annavad kogu pildile kollase varjundi. Fluorestseeruvate antikehade testides hinnatakse spetsiifilisust enamasti fluorokroomi iseloomuliku värvuse järgi. Seetõttu võib peene spetsiifilisuse hindamisel ülaltoodud BV ergastusmeetodi puudusel olla märkimisväärne mõju.
