Miks ma pean kasutama konfokaalset mikroskoopi?
1. Optiline mikroskoop on täiustatud meie suurte eelkäijate pingutuste ja täiustustega. Tegelikult annab tavaline mikroskoop meile lihtsalt ja kiiresti ilusaid mikroskoopilisi pilte. Sündmus, mis muutis peaaegu täiuslike mikroskoopide maailma, oli aga "laserskaneeriva konfokaalse mikroskoobi" leiutamine. Seda uut tüüpi mikroskoopi iseloomustab optiline süsteem, mis eraldab pildiinfot ainult pinnalt, millele fookus on kontsentreeritud ning fookust muutes samal ajal omandatud informatsiooni pildimällu taastades on võimalik saada terav pilt täielik 3-mõõtmeteave. Nii on võimalik hõlpsasti saada teavet pinna kuju kohta, mida tavapärase mikroskoobiga kinnitada ei saa. Lisaks, kuigi "lahutusvõime suurendamine" ja "teravustamise sügavuse suurendamine" on tavapäraste optiliste mikroskoopide jaoks vastuolulised tingimused, eriti suure suurenduse korral, lahendatakse see probleem konfokaalsete mikroskoopidega.
2. Konfokaalse optilise süsteemi eelised
Laserkonfokaalse mikroskoobi skemaatiline diagramm
Konfokaalne optiline süsteem on proovi punktvalgustus, samas kui peegeldunud valgus võetakse vastu ka punktretseptori abil. Kui proov asetatakse fookuspunkti, jõuab peaaegu kogu peegeldunud valgus fotoretseptorini ja kui proov on fookusest väljas, ei jõua peegeldunud valgus fotoretseptorisse. Teisisõnu, konfokaalses optilises süsteemis väljastatakse ainult fookuspunktiga kattuv pilt ning laigud ja kasutu hajutatud valgus blokeeritakse.
3. Miks kasutada laserit?
Konfokaalses optilises süsteemis valgustatakse näidist mingis punktis ja peegeldunud valgust võtab vastu punktsensor. Seetõttu on punktvalgusallikas vajalik. Laserid on väga punktvalgusallikad. Enamasti on konfokaalsete mikroskoopide valgusallikaks laservalgusallikas. Lisaks on laserite monokromaatilisus, suundumus ja suurepärane kiire kuju nende laialdase kasutuselevõtu olulised põhjused.
4. Võimalik on kiirel skaneerimisel põhinev reaalajas vaatlus.
Laserskaneerimisel kasutatakse horisontaalsuunas akustilist optilist kõrvalekaldeseadet (Acoustic Optical Deflector, AO prime) ja vertikaalsuunas servoelektroonilist juhitava kiirega skaneerimispeeglit (Servo Galvano-peegel). Kuna AO deflektoris puudub mehaaniline vibratsioon, on võimalik kiire skaneerimine ning võimalik on jälgida monitori ekraanil reaalajas. Selle kaamera suur kiirus on väga oluline punkt, mis mõjutab otseselt teravustamise kiirust ja asukoha otsimist.
5. Fookuse asendi ja heleduse vaheline seos
Konfokaalses optilises süsteemis asetatakse proov õigesti fookusasendisse, kui heledus on zui suur, selle ees ja taga väheneb selle heledus järsult (joonis 4 pidev joon). See fookustasandi tundlik selektiivsus on konfokaalse mikroskoobi kõrguse orientatsiooni ja fookuse laiendamise sügavuse põhimõte. Seevastu tavalised optilised mikroskoobid ei näita olulist heleduse muutust enne ja pärast fookusasendit (punktiirjoon joonisel 4).
6. Kõrge kontrastsus, kõrge eraldusvõime
Tavalises optilises mikroskoobis häirib mikroskoobi fookusest väljas olevast osast peegeldunud valgus mikroskoobi fokaalset kujutise osa ja kattub sellega, mille tulemuseks on pildi kontrastsuse vähenemine. Seevastu konfokaalses optilises süsteemis eemaldatakse fookuspunktist ja objektiivi seest hajutatud valgus peaaegu täielikult, mille tulemuseks on väga suure kontrastsusega pildid. Lisaks paraneb mikroskoobi lahutusvõime, kuna valgus läbib objektiivi kaks korda, muutes punktpildi teravamaks.
7. Optilise lokaliseerimise funktsioon
Konfokaalses optilises süsteemis varjab peegeldunud valgust mikro-ava teises punktis peale fookuspunkti. Selle tulemusena moodustub kolmemõõtmelise proovi vaatlemisel pilt nii, nagu oleks proov fookuspunktiga viilutatud (joonis 5). Seda efekti nimetatakse optiliseks lokaliseerimiseks ja see on üks konfokaalsete optiliste süsteemide omadusi.
