Mis on konfokaalse mikroskoobi eesmärk?
1. Pärast meie suurte eelkäijate jõupingutusi ja täiustusi on optiline mikroskoop saavutanud täiuslikkuse. Tegelikult saavad tavalised mikroskoobid meile lihtsalt ja kiiresti ilusaid mikroskoopilisi pilte anda. Siiski juhtus sündmus, mis tõi sellesse peaaegu täiuslikku mikroskoobimaailma revolutsioonilise uuenduse, milleks on "laserskaneeriva konfokaalse mikroskoobi" leiutis. Selle uut tüüpi mikroskoobi eripäraks on see, et see kasutab optilist süsteemi, mis eraldab pilditeabe ainult pinnalt, kuhu fookus on koondunud, ja taastab saadud teabe kujutise mällu, muutes fookust, nii et täielikku 3D-teavet saab kuvada. saadud. Karm pilt intelligentsusest. Selle meetodi abil on võimalik hõlpsasti saada teavet pinnakuju kohta, mida tavalise mikroskoobiga ei saa kinnitada. Lisaks on tavaliste optiliste mikroskoopide puhul "lahutusvõime suurendamine" ja "teravustamise sügavuse süvendamine" vastuolulised tingimused, eriti suure suurenduse korral on see vastuolu rohkem silmatorkav, kuid konfokaalsete mikroskoopide puhul on see probleem lihtsalt lahendatav.
2. Konfokaalse optilise süsteemi eelised
Laserkonfokaalse mikroskoobi skemaatiline diagramm
Konfokaalne optiline süsteem teostab proovi punktvalgustust ning peegeldunud valgust võtab vastu ka punktretseptor. Kui proov asetatakse fookusasendisse, võib peaaegu kogu peegeldunud valgus jõuda fotoretseptorini ja kui proov on fookusest väljas, ei jõua peegeldunud valgus fotoretseptorisse. See tähendab, et konfokaalses optilises süsteemis väljastatakse ainult fookuspunktiga kattuv pilt ning valguslaigud ja kasutu hajutatud valgus on varjestatud.
3. Miks kasutada laserit?
Konfokaalses optilises süsteemis valgustatakse proov ühes punktis ja peegeldunud valgust võtab vastu ka punktfotoretseptor. Seetõttu on vaja punktvalgusallikat. Laserid on väga punktvalgusallikad. Enamasti kasutatakse konfokaalsete mikroskoopide valgusallikatena laservalgusallikaid. Lisaks on laseri monokromaatilisuse, suunalisuse ja suurepärase kiire kuju omadused samuti olulised põhjused selle laialdaseks kasutuselevõtuks.
4. Võimalik on kiirel skaneerimisel põhinev reaalajas vaatlemine
Laserskaneerimisel kasutatakse akustiliselt aktiveeritavat optilist kõrvalekaldeseadet (Acoustic Optical Deflector, AO element) horisontaalsuunas ja Servo Galvano-peeglit vertikaalsuunas. Kuna akusto-optilisel läbipaindeseadmel pole mehaanilist vibratsiooniosa, saab see teostada kiiret skaneerimist ja võimalik on monitori ekraanil reaalajas jälgimine. See kiire pildistamine on väga oluline element, mis mõjutab otseselt teravustamise ja asukoha otsimise kiirust.
5. Fookuse asendi ja heleduse vaheline seos
Konfokaalses optilises süsteemis on proovi heledus maksimaalne siis, kui proov on õigesti fookusasendisse paigutatud ning selle heledus väheneb järsult enne ja pärast seda (pidev joon joonisel 4). Fokaaltasandi tundlik selektiivsus on ka konfokaalse mikroskoobi kõrguse suuna määramise ja fookussügavuse laiendamise põhimõte. Seevastu tavalistel optilistel mikroskoopidel ei ole enne ja pärast fookusasendit olulisi heleduse muutusi.
6. Kõrge kontrastsus, kõrge eraldusvõime
Tavalistes optilistes mikroskoopides kattub see fookusosalt peegeldunud valguse interferentsi tõttu fookuse pildistamise osaga, mille tulemuseks on pildi kontrastsuse vähenemine. Teisest küljest eemaldatakse konfokaalses optilises süsteemis fookuspunktist väljapoole hajutatud valgus ja objektiivi sees hajuv valgus peaaegu täielikult, nii et saab väga suure kontrastsusega pildi. Lisaks, kuna valgus läbib objektiivi kaks korda, teravatakse kõigepealt punktkujutis, mis parandab ka mikroskoobi lahutusvõimet.
7. Optilise lokaliseerimise funktsioon
Konfokaalses optilises süsteemis varjab mikropoor peegeldunud valgust, välja arvatud fookuspunktiga kokkulangev punkt. Seetõttu moodustub kolmemõõtmelise proovi vaatlemisel pilt, nagu oleks proov fookustasandiga viilutatud (joonis 5). Seda efekti tuntakse optilise lokaliseerimisena ja see on üks konfokaalsete optiliste süsteemide eripäradest.
8. Fookuse mobiilse mälu funktsioon
Nn peegeldunud valgus väljaspool fookuspunkti varjatakse mikropooridega. Teisest küljest võib arvestada, et kõik punktid kujutisel, mille moodustab konfokaalne optiline süsteem, langevad fookuspunktiga kokku. Seega, kui liigutada kolmemõõtmelist näidist mööda Z-telge (optilist telge), siis pildid akumuleeruvad ja salvestatakse mällu ning lõpuks saadakse kogu näidisest ja fookuspunktist moodustatud pilt. Sel viisil fookuse sügavuse lõpmatu süvendamise funktsiooni nimetatakse mobiilse mälu funktsiooniks.
9. Pinna kuju mõõtmise funktsioon
Fookuse nihutamise funktsiooni osas saab proovi pinna kuju mõõta kontaktivabalt, lisades pinna kõrguse salvestusahela. Selle funktsiooni alusel on võimalik igas pikslis salvestada maksimaalse heleduse väärtusega moodustatud Z-telje koordinaate ning selle info põhjal saab näidispinna kujuga seotud infot.
10. Kõrge täpsusega mikrosuuruse mõõtmise funktsioon
Valgust vastuvõtval seadmel on 1-mõõtmeline CCD-pildiandur, nii et skannimisseadme skaneerimise kalle ei mõjuta seda, nii et ülitäpse mõõtmise saab lõpule viia. Lisaks saab tänu reguleeritava fookussügavuse (süvendamisega) fookuse nihke mälufunktsiooni kasutamisele kõrvaldada fookuse nihkest põhjustatud mõõtmisviga.
11. Kolmemõõtmeline kujutise analüüs
Pinna kuju mõõtmise funktsiooni kasutades saate lihtsalt luua proovipinnast kolmemõõtmelise pildi. Lisaks sellele saab teha ka mitmesuguseid analüüse, näiteks: pinna kareduse mõõtmine, pindala, ruumala, pindala, ringikujulisus, raadius, maksimaalne pikkus, perimeeter, raskuskese, tomograafiline kujutis, FFT teisendus, joone laiuse mõõtmine jne .
Laserkonfokaalset skaneerivat mikroskoopi saab kasutada mitte ainult raku morfoloogia jälgimiseks, vaid ka rakusiseste biokeemiliste komponentide kvantitatiivseks analüüsiks, optilise tiheduse statistikaks ja raku morfoloogia mõõtmiseks.
