Kahe fotoni fluorestsentsmikroskoopial on palju eeliseid:
1) Valguse pikemaid lainepikkusi mõjutab hajumine vähem kui lühemaid valguse lainepikkusi, et läbida proovi;
(2) Fluorestseeruvaid molekule, mis asuvad väljaspool fookustasandit, ei ergutata, et fookustasandile jõuaks rohkem ergastusvalgust, nii et ergastusvalgus tungib proovi sügavamale;
3) Lähiinfrapuna valguse pikemad lainepikkused on rakkudele vähem toksilised kui lühemad lainepikkused;
4) Kui proovi vaatlemiseks kasutatakse kahefootonilist mikroskoopi, ilmneb fotopleegitamine ja fototoksilisus ainult fookustasandil. Seetõttu on kahefootonilised mikroskoobid sobivamad kui ühefootonilised mikroskoobid paksude proovide vaatlemiseks, elusrakkude vaatlemiseks või täppide fotovalgendamise katsete läbiviimiseks.
Konfokaalse fluorestsentsmikroskoobi teadmised
Konfokaalse fluorestsentsmikroskoobi põhiprintsiip: proovi kiiritamiseks kasutatakse punktvalgusallikat, mis moodustab fookustasandil väikese, täpselt määratletud valguspunkti. Sellest punktist pärast kiiritamist eralduv fluorestsents kogutakse objektiivi läätsele ja saadetakse piki algset kiiritusvalguste teed tagasi kiirjagurisse, mis koosneb kahesuunalisest kromaatilisest peeglist. Kiirjaotur saadab fluorestsentsi otse detektorisse. Nii valgusallikal kui ka detektoril on mõlema ees tihvtiauk, mida nimetatakse vastavalt valgustusnõelaauguks ja tuvastusnõelaauguks. Mõlemal on sama geomeetria, umbes 100-200 nm, ja need on fookustasandi valguspunkti suhtes konjugeeritud, st valguspunkt läbib läätsede seeriat ja saab lõpuks fokuseerida mõlemale valgustavale. ja detektori augud. Sel viisil võib fookustasandilt tulev valgus sondi apertuuris koonduda, samas kui fookustasandist ülevalt või altpoolt tulev hajutatud valgus on blokeeritud väljaspool sondi ava ja seda ei saa pildistada. Laser skaneerib proovi punkt-punktilt ning fotokordisti toru saab pärast nööpnõela tuvastamist ka punkt-punktilt vastava valguspunkti konfokaalse pildi, mis muundatakse digitaalseks signaaliks ja edastatakse arvutisse ning lõpuks koondub selgeks. kogu fookustasandi konfokaalne kujutis ekraanil.
Iga fokaaltasandi kujutis on tegelikult näidise optiline ristlõige ja sellel optilisel ristlõikel on alati teatud paksus, mida tuntakse ka optilise lehe nime all. Kuna valguse intensiivsus fookuspunktis on palju suurem kui mittefookuspunktis ja mittefokaaltasandiline valgus filtreeritakse nööpnõela abil välja, on konfokaalse süsteemi teravussügavus ligikaudne null ja skaneerimine Z-telje suunas võimaldab optiline tomograafia moodustada proovist kahemõõtmelise optilise lõigu, mida fookuspunktis jälgida. Kombineerides XY tasapinna (fokaaltasandi) skaneerimist Z-telje (optilise telje) skaneerimisega, saab proovist kolmemõõtmelise kujutise saada kahemõõtmeliste kujutiste järjestikuste kihtide kogumisel, mida töödeldakse spetsiaalse arvutitarkvaraga.
See tähendab, et tuvastusnõelaauk ja valgusallika tihvtiauk on alati fokuseeritud samasse punkti, nii et väljaspool fookustasandit ergastav fluorestsents ei pääse tuvastamise auku.
Laserkonfokaali tööpõhimõte on lihtsalt väljendatud selles, et see kasutab laserit valgusallikana traditsioonilise fluorestsentsmikroskoobi kujutise, täiendava laserskaneerimisseadme ja konjugeeritud teravustamisseadme alusel arvuti juhtimise kaudu digitaalse kujutise hankimise ja töötlemise süsteemi teostamiseks.
