Kahefotoni fluorestsentsmikroskoopial on palju eeliseid
1) Pika lainepikkusega valgust mõjutab hajumine vähem kui lühikese lainepikkusega valgust ja see võib proovist kergesti tungida;
2) Fluorestseeruvad molekulid väljaspool fookustasandit ei ergastu, võimaldades rohkem ergastusvalgust jõuda fookustasandile, võimaldades ergastusvalgusel tungida sügavamatesse proovidesse;
3) pika lainepikkusega lähiinfrapunavalgus on rakkudele vähem toksiline kui lühikese lainepikkusega valgus;
4) Proovide vaatlemisel kahe footoni mikroskoobiga ilmneb fotopleegitamine ja fototoksilisus ainult fookustasandil. Seetõttu on kahefotonilised mikroskoobid sobivamad kui ühefootonilised mikroskoobid paksude proovide vaatlemiseks, elusrakkude vaatlemiseks või fikseeritud punktiga fotovalgenduse katsete tegemiseks.
Teadmised konfokaalse fluorestsentsmikroskoopia kohta
Konfokaalse fluorestsentsmikroskoopia põhiprintsiip: kasutage proovi valgustamiseks punktvalgusallikat, et moodustada fookustasandil väike, täpselt määratletud valgustäpp. Objektiivi lääts kogub täpi poolt kiiratud fluorestsentsi pärast valgustamist kokku ja suunab algse valgustusraja kaudu tagasi dikrooisse peeglisse. moodustavad kiire jaoturi. Spektromeeter saadab fluorestsentsi otse detektorisse. Valgusallika ja detektori ees on nõelaauk, mida nimetatakse vastavalt valgustusnõelaauguks ja tuvastusnõelaauguks. Nende kahe geomeetrilised mõõtmed on ühtsed, umbes 100-200nm; fookustasandi valguspunkti suhtes on need kaks konjugeeritud, see tähendab, et valguspunkt läbib läätsede seeriat ja saab lõpuks fokuseerida valgustusnõelaaugule ja tuvastusnõelaaugule samal ajal. Sel viisil saab fookustasandi valgust koondada tuvastusavasse, samal ajal kui fookustasandist ülevalt või altpoolt tulev hajutatud valgus blokeeritakse väljaspool tuvastusava ja seda ei saa pildistada. Proov skaneeritakse laseriga punkt-punktilt ning tuvastusnõela taga asuv fotokordisti toru saab punkt-punktilt ka vastava valguse konfokaalse pildi, mis muundatakse digitaalseks signaaliks ja edastatakse arvutisse ning lõpuks agregeeritakse. ekraanil kogu fookustasandi selgeks konfokaalseks kujutiseks. .
Iga fokaaltasandi kujutis on tegelikult proovi optiline ristlõige. Sellel optilisel ristlõikel on alati teatud paksus ja seda nimetatakse ka optiliseks õhukeseks ristlõikeks. Kuna valguse intensiivsus fookuses on palju suurem kui mittefookuse valguse intensiivsus ja mittefokaaltasandiline valgus filtreeritakse nööpaugu abil, on konfokaalse süsteemi teravussügavus ligikaudu null. Skaneerimine mööda Z-telje suunda võib teostada optilise tomograafia, moodustades soovitud. Jälgige kahemõõtmelist optilist lõiku proovi fookuspunktis. Kombineerides XY tasapinna (fokaaltasandi) skaneerimise Z-telje (optilise telje) skaneerimisega, akumuleerides kahemõõtmeliste kujutiste pidevaid tasemeid ja töödeldes neid spetsiaalse arvutitarkvaraga, on võimalik saada proovist kolmemõõtmeline kujutis.
See tähendab, et tuvastusnõelaauk ja valgusallika tihvtiauk on alati fokuseeritud samasse punkti, nii et väljaspool fookustasandit ergastatud fluorestsents ei pääse tuvastamise auku.
Laserkonfokaalse tööpõhimõtte lihtne väljendus seisneb selles, et see kasutab valgusallikana laserit. Traditsioonilise fluorestsentsmikroskoobi kujutise põhjal lisatakse laserskaneerimisseade ja konjugeeritud teravustamisseade ning süsteemi juhitakse arvuti abil digitaalsete kujutiste kogumiseks ja töötlemiseks.
