Optilise mikroskoobi peamine vaatlusmeetod on fluorestsentsvaatlus
Fluorestsents viitab protsessile, mille käigus fluorestseeruv aine kiirgab peaaegu samaaegselt pikema lainepikkusega valgust, kui seda kiiritatakse kindla lainepikkusega valgusega (joonis 1). Kui teatud lainepikkusega (ergastuslainepikkusega) valgus tabab molekuli, näiteks fluorofooris olevaid, neelduvad footoni energia molekuli elektronid. Järgmisena lähevad elektronid üle põhiolekust (S0) kõrgemale energiatasemele, ergastatud olekusse (S1'). Seda protsessi nimetatakse ergastamiseks①. Elektron viibib ergastatud olekus 10-9–10-8 sekundit, mille jooksul elektron kaotab osa energiast②. Ajal, mil elektronid väljuvad ergastatud olekust (S1) ja naasevad põhiolekusse③, vabaneb ergastusprotsessi käigus neeldunud ülejäänud energia.
Fluorestseeruva molekuli viibimisaeg ergastatud olekus on fluorestsentsi eluiga, mis on üldiselt nanosekundi tasemel ja on fluorestsentsmolekuli enda omane omadus. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), mis kasutab fluorestsentsi eluaegse pildistamise tehnoloogiat, nimetatakse fluorestsentseluaegseks kujutiseks (FLIM). Lisaks fluorestsentsi intensiivsusega pildistamisele on võimalik saada põhjalikumaid funktsionaalseid ja täpsemaid mõõtmisi, et saada molekulide konformatsiooni, molekulidevahelisi interaktsioone ja mikrokeskkonda. Teave, mida on tavapärase optilise pildistamise abil raske saada.
Fluorestsentsi teine oluline omadus on Stokesi nihe ehk lainepikkuste erinevus ergastuse ja emissiooni piikide vahel (joonis 2). Tavaliselt on emissiooni lainepikkus pikem kui ergastuse lainepikkus. Selle põhjuseks on asjaolu, et elektronid kaotavad osa oma energiast lõõgastusprotsessi käigus pärast fluorestseeruva aine ergastamist ja enne footonite vabastamist. Suuremate Stokesi nihkega fluorestseeruvaid aineid on fluorestsentsmikroskoobi all lihtsam jälgida.
Fluorestsentsmikroskoopia ja fluorestsentsfiltri kuubikud
Fluorestsentsmikroskoop on optiline mikroskoop, mis kasutab vaatluseks ja pildistamiseks fluorestsentsomadusi ning mida kasutatakse laialdaselt erinevates valdkondades, nagu rakubioloogia, neurobioloogia, botaanika, mikrobioloogia, patoloogia ja geneetika. Fluorestsentskujutise eelisteks on kõrge tundlikkus ja kõrge spetsiifilisus ning see sobib väga hästi spetsiifiliste valkude ja organellide jaotumise jälgimiseks kudedes ja rakkudes, kolokalisatsiooni ja interaktsiooni uurimiseks, elu dünaamiliste protsesside (nt ioonide kontsentratsiooni muutuste) jälgimiseks. , jne.
Enamik rakkude molekule ei fluorestseeru ja nende nägemiseks peavad need olema fluorestseeruvalt märgistatud. Fluorestsentsmärgistamiseks on palju meetodeid, nagu otsene märgistamine (näiteks DAPI kasutamine DNA märgistamiseks) või immunovärvimine, kasutades antikehade antigeeni siduvaid omadusi, või fluorestseeruvate valkude (nt GFP, roheline fluorestseeruv valk) kasutamine sihtvalkude märgistamiseks. , ja pööratav köitmine. Sünteetilised värvained (nt Fura-2) ja nii edasi.
Praeguseks on fluorestsentsmikroskoobist saanud erinevate laborite ja pildiplatvormide standardne pildistamisseade ning see on hea abimees meie igapäevastes katsetes. Fluorestsentsmikroskoobid jagunevad peamiselt kolme kategooriasse: püstised fluorestsentsmikroskoobid (sobivad viilutamiseks), pöördfluorestsentsmikroskoobid (sobivad elusrakkudele, võttes arvesse viilutamist), fluorestsents-stereoskoobid (sobivad suurematele isenditele, nagu taimed, sebrakala (täiskasvanud/embrüo). ), medaka, hiire/roti organid jne).
Fluorestsentsfiltri plokk on mikroskoobi fluorestsentskujutise põhikomponent. See koosneb kolmest osast: ergutusfilter, emissioonifilter ja dikroonse kiire jaotur. See on paigaldatud filtrirattasse. Näiteks Leica DMi8 on varustatud 6-asendifiltrirattaga (joonis 3). Erinevate mikroskoobirataste positsioonide arv on erinev ja mõned mikroskoobid kasutavad filtriploki slaide.
Filtriplokil on fluorestsentspildistamisel oluline roll: ergastusfilter valib proovi ergastamiseks ergastava valguse ja blokeerib muu lainepikkusega valguse; ergastusfiltrit läbiv valgus läbib dikrootilisi peegli (selle ülesanne on ergastavat valgust peegeldada ja fluorestsentsi edastada), pärast peegeldumist fokusseeritakse see objektiivi abil, kiiritab proovi ja ergastab vastava fluorestsentsi, st. , kiirgab valgust. Objektiivi lääts kogub kiirgava valguse, läbib dikroonse kiire jaoturi ja jõuab emissioonifiltrini. Nagu on näidatud joonisel 4: ergastuse lainepikkus on 450-490 nm, dikroonne peegel peegeldab valgust, mis on lühem kui 510 nm, laseb läbi valgust, mis on pikem kui 510 nm, ja kiiratava valguse vastuvõtuulatus on 520-560 nm.
