Optilise mikroskoobi peamine vaatlusmeetod on fluorestsentsvaatlus
Fluorestsentsi nähtus
Fluorestsents viitab protsessile, mille käigus fluorestseeruv aine kiirgab peaaegu samaaegselt pikema lainepikkusega valgust, kui seda kiiritatakse kindla lainepikkusega valgusega (joonis 1). Kui kindla lainepikkusega (ergastuslainepikkusega) valgus tabab molekuli (näiteks molekuli fluorofooris), neelavad footoni energia molekuli elektronid. Järgmisena lähevad elektronid üle põhiolekust (S0) kõrgemale energiatasemele, ergastatud olekusse (S1'). Seda protsessi nimetatakse ergastamiseks①. Elektron viibib ergastatud olekus 10-9–10-8 sekundit, mille jooksul elektron kaotab osa energiast ②. Ergastatud olekust (S1) väljumisel ja põhiolekusse ③ naasmisel vabaneb ergutusprotsessi käigus neeldunud ülejäänud energia.
Fluorestseeruva molekuli viibimisaeg ergastatud olekus on fluorestsentsi eluiga, tavaliselt nanosekundites, mis on fluorestsentsmolekuli enda omane omadus. Fluorestsentsi eluiga pildistamise tehnoloogiat nimetatakse fluorestsentsi eluiga pildistamiseks (FLIM), mis suudab lisaks fluorestsentsi intensiivsuse pildistamisele teostada ka põhjalikumaid funktsionaalseid ja täpsemaid mõõtmisi, et saada molekulaarset konformatsiooni, molekulidevahelisi interaktsioone ja molekulaarseid mikrokeskkondi. teavet, mida on tavapärase optilise pildistamise abil raske saada.
Fluorestsentsi teine oluline omadus on Stokesi nihe ehk lainepikkuste erinevus ergastuse ja emissiooni piikide vahel (joonis 2). Tavaliselt on emissioonivalguse lainepikkus pikem kui ergastusvalguse lainepikkus. Seda seetõttu, et pärast fluorestseeruva aine ergastamist ja enne footoni vabanemist kaotavad elektronid lõdvestusprotsessi käigus osa energiast. Suuremate Stokesi nihkega fluorestseeruvaid aineid on fluorestsentsmikroskoobi all lihtsam jälgida.
Fluorestsentsmikroskoobid ja fluorestsentsfiltriplokid
Fluorestsentsmikroskoopia on optiline mikroskoop, mis kasutab vaatlemiseks ja pildistamiseks fluorestsentsomadusi ning mida kasutatakse laialdaselt rakubioloogias, neurobioloogias, botaanikas, mikrobioloogias, patoloogias, geneetikas ja muudes valdkondades. Fluorestsentskujutise eelisteks on kõrge tundlikkus ja kõrge spetsiifilisus ning see sobib väga hästi spetsiifiliste valkude, organellide jms jaotumise jälgimiseks kudedes ja rakkudes, kooslokaliseerumise ja interaktsiooni uurimiseks ning eludünaamika jälgimiseks. protsessid, nagu muutused ioonide kontsentratsioonis.
Enamik rakkude molekule ei fluorestseeru ja nende nägemiseks peavad need olema fluorestseeruvalt märgistatud. Fluorestsentsmärgistamiseks on palju meetodeid, mida saab otse märgistada (nt DAPI kasutamine DNA märgistamiseks) või immunovärvimine, kasutades antikehade antigeeni siduvaid omadusi, või sihtvalku saab märgistada fluorestseeruvate valkudega (nt GFP, roheline fluorestseeruv valk) või pöörduv seondumine. sünteetilised värvained (nt Fura-2) jne.
Praeguseks on fluorestsentsmikroskoobist saanud erinevate laborite ja pildiplatvormide standardne pilditehnika ning see on hea abimees meie igapäevastes katsetes. Fluorestsentsmikroskoobid jagunevad peamiselt kolme kategooriasse: püstised fluorestsentsmikroskoobid (sobivad lõikamiseks), pöördfluorestsentsmikroskoobid (sobivad elusrakkudele, võttes arvesse sektsioone), fluorestsents-stereoskoopmikroskoobid (sobivad suurematele isenditele, nagu taimed, sebrakala (täiskasvanud/ embrüo), medaka, hiire/roti organid jne).
Fluorestsentsfiltri plokk on mikroskoopides fluorestsentskujutise põhikomponent. See koosneb ergastusfiltrist, emissioonifiltrist ja dikroonse kiire jaoturist. See on paigaldatud filtrirattasse, näiteks Leica DMi8, mis on varustatud 6-asendifiltrirattaga (joonis 3). ). Erinevatel mikroskoopidel on erinevad rataste asendid ja mõned mikroskoobid kasutavad filtriklaase.
Filtriplokil on fluorestsentspildistamisel oluline roll: ergastusfilter valib proovi ergastamiseks ergastava valguse ja blokeerib muud valguse lainepikkused; ergastusfiltrit läbiv valgus läbib dikroonset kiirjagurit (selle ülesanne on ergastavat valgust peegeldada ja fluorestsentsi edastada), pärast peegeldumist fokusseeritakse see objektiivi abil, kiiritatakse proovile ja vastav fluorestsents ergastatakse kiirgavad valgust. Objektiivi lääts kogub kiirgava valguse, läbib dikroilise valgusvihu jaoturi ja jõuab emissioonifiltrini. Nagu on näidatud joonisel 4: ergastuse lainepikkus on 450-490 nm, dikroonse kiire jaotur peegeldab valgust, mis on lühem kui 510 nm, edastab valgust, mis on pikem kui 510 nm, ja emissioonivalguse vastuvõtuvahemik on 520-560 nm.
Fluorestsentsmikroskoopides tavaliselt kasutatavad fluorestsentsfiltrid võib jagada kahte tüüpi: pikk läbilaskevõime (lühendatult LP) ja ribapääs (lühendatult BP). Ribalassi määrab tavaliselt kesklainepikkus ja intervalli laius, näiteks 480/40, mis tähendab, et 460-500nm valgust saab läbida. Pikkpääsfiltrid, nagu 515 LP, läbivad valgust, mille lainepikkus on üle 515 nm (joonis 5).
Fluorestseeruvatel ainetel on iseloomulik ergastus- (neeldumis-) kõver ja emissioonikõver, ergastuse tipp on ideaalne ergastuse lainepikkus (kõrge ergastuse efektiivsus, mis võib vähendada ergastusvalguse energiat, kaitsta rakke ja värvaineid) ja emissioonikõver on emissiooni fluorestsentsi lainepikkus. ulatus. Seetõttu valime katses ergastamiseks võimalikult lähedase ergastuspiigi lainepikkuse ja vastuvõtuvahemik peab sisaldama emissioonipiiki. Näiteks Alexa Fluor 488 ergastuspiik on 500 nm ja ergastusfiltri 480/40 saab valida fluorestsentsmikroskoobis.
Filtrikuubikute üksikasju saab vaadata mikroskoobi kujutise tarkvaras. Värvainete mõistmine ja teie prooviga kõige paremini sobiva filtri leidmine on fluorestsentskujutise jaoks ülioluline. Fluorestseeruvate värvainete ja fluorestseeruvate valkude spektraalteave on üldjuhul juhendis ära toodud ning selle leiab ka veebist.
Lisaks fluorestsentssondide ergastus- ja emissioonilainepikkustele tuleb filtriplokkide valikul arvestada ka mittespetsiifilise ergastuse olemasolu ja mitmevärvilise märgistusega proovide ristvärvi olemasolu. Lisaks tuleb arvestada kasutatava fluorestsentsvalgusallikaga. Praegu on tavaliselt kasutatavad luminofoorvalgusallikad elavhõbedalambid, metallhalogeniidlambid ja LED-valgusallikad, mis on viimastel aastatel kiiresti arenenud. Luminofoorvalgusallika spekter on pidev või katkendlik ning energia on erinevates lainepikkuste ribades erinev. LED-valgusallikas on järk-järgult muutumas fluorestsentsmikroskoobi peamiseks valgusallikaks tänu oma suhteliselt kitsale spektriribale, stabiilsemale energiaväljundile, pikale elueale, ohutumale ja keskkonnakaitsele ning paljudele muudele eelistele.
Lisaks mikroskoobi sisseehitatud filtriplokile on olemas ka väline kiirratas (joonis 7). Leica välise kiire rattaga külgneva filtri konversioonikiirus on 27 ms, mis võimaldab teostada kiireid mitmevärvilisi katseid, nagu FRET ja Fura2 suhtega kaltsiumipildistamine. (joonis 8) jt.
Lai valik fluorestsentsmikroskoopia kujutise tehnikaid
Erinevate fluorestsentskuvamise vajaduste rahuldamiseks on lisaks fluorestsentsmikroskoopidele välja töötatud ka erinevaid fluorestsentsmikroskoopia kujutise lahendusi:
Laia väljaga kõrglahutusega pildisüsteemid, nagu Leica THUNDER Imager, kasutavad Leica uuenduslikku Clearing tehnoloogiat, et eemaldada pildistamise ajal tõhusalt mittefokaaltasandilisi häiresignaale, pakkudes selgeid pilte ja kiire pildistamise eeliseid;
Konfokaalne laserskaneeriv mikroskoop kasutab nööpnõelasid, et kõrvaldada mittefokaaltasandilised häired, teostab optilist sektsiooni ning saadakse kõrglahutusega pilte ja kolmemõõtmelisi kujutisi;
Ülikõrge eraldusvõimega mikroskoobid ja nanomikroskoobid, mis läbivad difraktsioonipiiri, suudavad jälgida peenstruktuure, mis on väiksemad kui 200 nm;
Mitmefotoni kujutise süsteem, mis kasutab multifotoni ergastuse põhimõtet paksu koe ja sügava in vivo pildistamiseks;
Kõrge ajalise ja ruumilise eraldusvõimega valguslehtede kujutise tehnoloogia, kiire pildistamiskiirus, kõrge eraldusvõime, madal fototoksilisus, eriti sobiv arendusuuringuteks ja in vivo dünaamilisteks vaatlusteks;
Fluorestsentskujutis (FLIM), mida ei mõjuta sellised tegurid nagu fluorestseeruva aine kontsentratsioon, fotopleegitamine, ergastusvalguse intensiivsus jne, võib teostada põhjalikumaid funktsionaalseid ja täpsemaid mõõtmisi;
Fluorestsentskorrelatsioonspektroskoopia (FCS) ja fluorestsentskorrelatsioonspektroskoopia (FCCS) mõõdavad fluorestseeruvate molekulide molekulaararvu ja difusioonikoefitsienti, analüüsides seeläbi molekulide kontsentratsiooni, molekuli suurust, viskoossust, molekulide liikumist, molekulide sidumist/dissotsiatsiooni ja omadusi;
Ülikõrge z-telje eraldusvõimega täielik sisepeegeldusfluorestsentsmikroskoopia (TIRF) on ideaalne rakumembraani pindade molekulaarstruktuuri ja dünaamika uurimiseks.
