Positiivse ja negatiivse faasikontrastsuse erinevus mikroskoobis
Sõltuvalt objektiivi tagumise fookustasandil paikneva faasirõnga konfiguratsioonist ja olemusest võib proove jälgida positiivse või negatiivse faasikontrastsusega. See interaktiivne õpetus uurib seost ruumilise heli (S), difraktsiooni (D) ja sellest tulenevate eredate osakeste (P-lained) ning positiivse ja negatiivse faasikontrastmikroskoopia vahel. Lisaks esitatakse ka faasiplaadi geomeetria ja esinduslikud näidispildid.
Kui inimesed seda praegu oma töös kasutavad, on enamik teadlasi negatiivses erinevuses ja praegu ei mängi positiivne erinevus praeguses teaduslikus uurimistöös erilist rolli.
Õpetus initsialiseerib faasipildi juhuslikult valitud näidisega, mis ilmub Phase Contrast Image aknas ja vastavat lainesuhet näidatakse pildiakna vasakpoolses naabris. Õpetuse kasutamiseks kasutage hiirekursorit, et liigutada positiivse ja negatiivse faasikontrasti või ereda valgustuse faasikontrastsuse režiimi liugurit. Kui liugur on tõlgitud, muudavad faasikontrastsuse pildiaknas kuvatavad kujutised seda, kuidas näidis kuvatakse liuguriga määratud praeguses pildistamisrežiimis. Samuti on lainekuju graafiku all faasiplaat, mis muudab kuju, et see sobiks liuguriga valitud pildistamisrežiimiga. Uue proovi vaatamiseks kasutage teise proovi valimiseks rippmenüüd Valitud proov.
Positiivse ja negatiivse faasikontrastpiltide genereerimisega seotud faasiplaadi konfiguratsiooni, lainesuhete ja vektorite graafik on esitatud joonisel 1. Samuti on näidatud nende meetoditega pildistatud proovide näited. Positiivse faasikontrastsusega optilise konfiguratsiooni korral (pildi ülemine rida joonisel 1) läbib ruumiline (S)-lainefront läbi faasiplaadi, mille tulemuseks on faasinihe 180 kraadi võrra 1/4 lainepikkuse võrra ( 1 pool lainepikkust). Täiustatud ruumilise heli lainefrondid on nüüd võimelised osalema kujutise vahetasandil hajuvate (D) lainete hävitavates häiretes. Enamikul juhtudel ei piisa ainult ümbritseva lainefrondi suhtelise faasi edasiarendamisest Nikoni mikroskoopides suure kontrastsusega kujutiste genereerimiseks. Selle põhjuseks on asjaolu, et ruumiliste lainete amplituud on oluliselt suurem kui difrakteerunud lainete amplituud ja pärsib lainete koguarvu murdosa tekitatud häireid. Ümbritseva lainefrondi vähendamiseks difraktsioonilainete amplituudile lähedasema väärtuseni (ja pilditasapinnas interferentsi tekitamiseks) saadakse objektiivi faasirõngas läbipaistmatus poolläbipaistva metalli (neutraalne suurenev tihedus) abil. ) kate Põrand. Ümbritsevad valguslained, mis läbivad faasikontrastmikroskoopias peaaegu täielikult faasirõngast, vähenevad faasiplaadi läbipaistmatuse tõttu oluliselt amplituudiga, mis jääb vahemikku 10–30 protsenti algsest intensiivsusest.
Kuna saadud osakeste laine tekib ümbritsevate ja hajutatud lainefrontide interferentsist*, on kujutise tasapinnale saabuvate lainefrontide vahelisest interferentsist tekkiva osakese (P) laine amplituud nüüd seksuaalses režiimis palju väiksem kui ümbritseval. peale kantud tiheduskate. Netoefekt on teisendada suhteline faasierinevus, mis tekib kujutise tasapinnalt läbi katsekeha väljuva valguse läbimisel, amplituudi (intensiivsuse) erinevuseks. Kuna inimsilm tõlgendab intensiivsuse erinevust kontrastina, on proov nüüd mikroskoobi okulaaris nähtav ja seda saab jäädvustada ka membraanile tavaliste kaamerasüsteemidega või digitaalselt, kasutades CCD või CMOS seadmeid. Kõik positiivse faasikontrastsüsteemid viivad valikuliselt edasi lineaarse ruumilise (S) lainefrondi faasi võrreldes sfäärilise difraktsiooniga (D) lainefrondiga. Ümbritsevast keskkonnast kõrgema murdumisnäitajaga proovid näivad neutraalhallil taustal tumedamad, ujumiskeskkonnast madalama murdumisnäitajaga isendid aga hallist taustast heledamad.
Faasi ja amplituudi ümbritseva faasi ja amplituudi ruumilise eraldatuse muutmiseks faasikontrastses optilises süsteemis on kasutusele võetud mitmeid faasiplaatide konfiguratsioone. Kuna faasiplaat asub objektiivi tagumisel fokaaltasandil (difraktsioonitasapinnal) või sellele väga lähedal, peab kogu mikroskoopi läbiv valgus liikuma läbi selle komponendi. Faasiplaadi osa selle kondensaatori rõngakujulises fookuses nimetatakse konjugeeritud piirkonnaks, ülejäänud piirkonda aga komplementaarseks piirkonnaks. Konjugeeritud piirkond sisaldab materjali, mis vastutab ümbritseva (difraktsioonita) valguse faasi muutmise eest kas pluss või miinus 90 kraadi võrra hajutatud lainefrondi suhtes. Üldiselt on faasikonjugeeritud rõnga pindala laiem (umbes 25 protsenti) kui ala, mis on määratletud kondenseeruva rõnga kujutisega, et vähendada ümbritseva valguse hulka, mis levib komplementaarsele alale.
Enamik kaasaegsetelt mikroskoobitootjatelt saadaolevaid faasiplaate on üks neist, mis on valmistatud õhukeste dielektriliste ja metallkilede vaakum-sadestamise teel klaasplaadile või paigaldatud otse mikroskoobi objektiivi läätse pinnale. Dielektrilise kile ülesanne on valgust faasida, metallkile aga nõrgendab hajutamata valguse intensiivsust. Mõned tootjad kasutavad mitut peegeldusvastast kattekihti koos kilega, et vähendada pimestamist ja hajuva valguse tagasipeegeldust optilisse süsteemi. Kui faasiplaat ei ole moodustatud objektiivi pinnale, on see tavaliselt tsementeeritud järjestikuste läätsede vahele, mis asuvad fookustasandil objektiivi tagaosa lähedal. Dielektriliste, metallide ja peegeldusvastaste katete, aga ka optilise tsemendi paksus ja murdumisnäitaja valitakse hoolikalt, et tekitada soovitud faasinihe faasiplaadi komplementaarsete ja konjugeeritud piirkondade vahel. Optiliselt nimetatakse faasiplaati, mis muudab faasi ümbritseva valguse suhtes 90 kraadi võrra (kas positiivseks või negatiivseks) valguse difraktsiooniks, veerandlaineplaadiks, kuna sellel on optilise tee erinevuse mõju.
Positiivse faasi pöördväärtuse ülevaade on näidatud joonisel 1. Positiivse faasi kontrastplaat (joonisel 1 vasakpoolne külg) tõukab ruumilist lainet 1/4 lainepikkuse võrra, tänu klaasplaadis olevale erosioonirõngale, mis võib vähendatakse kõrge indeksiga plaadi ülemise läbipääsu võrra. Laine füüsiline teekond. Prooviga interaktsiooni tõttu, kui difraktsiooniga proovikiired (D) on aeglustunud, on faasiplaadilt väljuvate ümbritsevate ja difrakteerunud lainete optilise tee erinevus pool lainepikkust 1/4 lainepikkusest. Lõpptulemuseks on 180-kraadine optilise tee erinevus ümbritsevate ja difraktsiooniga lainete vahel, mille tulemuseks on destruktiivsed häired kõrge murdumisnäitajaga proovide puhul pilditasandite vahel. Destruktiivse interferentsi laine vastassuunalise positiivse faasi amplituudikõver on näidatud joonise 1 ülemisel graafikul. Saadud osakese (P) lainel on väiksem amplituud kui ruumilisel (S) lainel, mistõttu objekt näib võrreldes suhteliselt suhteliselt lainega. tumedam taust. All, paremal Zygnema rohevetikate kujutis (sildiga DL). Vektor, mida kujutab 1/4 lainepikkuse edenemine, mis on kujutatud 90-kraadi vastupäeva pöörleva ruumilise laine positiivse faasikontrastsusega, ilmub joonise ja joonisel 1 oleva kujutise vahele.
Alternatiivina võib mikroskoobi optikat valmistada ka negatiivse vastupidise faasi tekitamiseks, nagu on näidatud joonise fig 1 alumises osas. Sel juhul on ruumilised (S) lained edasi lükatud (mitte edasiliikumisel) veerandi lainepikkuse võrra. üks difraktsiooniga (D) laine. Selle tulemusena paistavad kõrge murdumisnäitajaga proovid tumedamal hallil taustal heledamad (vt alumist pilti, millel on tähis BM joonisel 1). Negatiivses vastasfaasis sisaldab objektiivi faasiplaat kõrgendatud rõngast, mis aeglustab faasi (mitte liigutab faasi positiivse faasina edasi), läbides neljandiku lainepikkust difraktsioonilaine faasi suhtes nulljärgu ruumilainena. Kuna difraktsiooniga lained on proovi läbimisel veerandi lainepikkuse võrra edasi lükatud, elimineeritakse optilise tee erinevus ümbritsevate ja difrakteerunud lainete vahel ning kõrge murdumisnäitajaga proov häirib konstruktiivselt kujutise tasapinda. Pange tähele, et saadud osakese (P) laine on negatiivse faasikontrastsuse korral suurem amplituudiga kui ruumilise (S) laine. Samuti on näidatud negatiivne faasi pööre, kus ümbermaailmareisi lainevektor läbib vektordiagrammi 90 kraadi päripäeva.
