Kahefotoni fluorestsentsmikroskoobi tehnilised omadused ja kasutusoskused
Kahe fotoni fluorestsentsmikroskoopia on uus tehnoloogia, mis ühendab laserskaneeriva konfokaalse mikroskoopia ja kahe fotoni ergastustehnoloogia.
Kahe footoni ergastuse põhiprintsiip on: suure footonitiheduse korral suudavad fluorestseeruvad molekulid neelata korraga kahte pikalainelist footoni ning pärast lühikest nn ergastatud oleku eluea perioodi kiirgavad lühema lainepikkusega footoni. . ; Mõju on sama, mis fluorestseeruva molekuli ergastamiseks footoni kasutamisel, mille lainepikkus on pool pikast lainepikkusest. Kahe footoni ergastamiseks on vaja suurt footoni tihedust. Selleks, et rakke mitte kahjustada, kasutatakse kahe fotoni mikroskoopias suure energiaga režiimilukuga impulsslasereid. Selle laseri kiirgav laser on kõrge tippenergia ja madala keskmise energiaga, selle impulsi laius on vaid 100 femtosekundit ja selle periood võib ulatuda 80–100 megahertsini. Kui kasutada impulsslaseri footonite teravustamiseks suure numbrilise avaga objektiivi, on footonite tihedus objektiivi fookuspunktis suurim ja kahe footoni ergastus toimub ainult objektiivi fookuspunktis, nii et kahe fotoni mikroskoop ei vaja konfokaalset tihvti, mis parandab fluorestsentsi tuvastamise efektiivsust. See on oluline uurimismeetod morfoloogia, molekulaarrakubioloogia, neuroteaduse ja farmakoloogia valdkonnas.
1. Kahefotoni mikroskoopia tekkimise taust – traditsioonilise laserkonfokaalse mikroskoopia kaks piirangut:
1) Üks on fototoksilisuse nähtus: kuna konfokaalne nööpnõel peab olema kõrge eraldusvõimega kujutise saamiseks piisavalt väike ja väike ava blokeerib suure osa proovist eralduvast fluorestsentsist, sealhulgas fookustasandilt eralduvast fluorestsentsist, vastav Jah, ergutusvalgus peab olema piisavalt tugev, et saada piisav signaali-müra suhe; ja suure intensiivsusega laser põhjustab pideva skaneerimise ajal fluorestseeruva värvaine kiiret tuhmumist ja fluorestsentssignaal muutub skaneerimise edenedes aina nõrgemaks.
2) Fototoksilisus on teine probleem. Laserkiirguse korral toodavad paljud fluorestseeruvad värvimolekulid tsütotoksiine, nagu üksikud hapnik või vabad radikaalid, seega tuleks proovi tiheduse säilitamiseks katses piirata skaneerimisaega ja ergastava valguse optilise võimsuse tihedust. aktiivne. Aktiivsete proovide uuringutes, eriti aktiivsete proovide kasvu ja arengu eri etappides, muudavad fotopleegitamine ja fototoksilisus need uuringud väga piiratuks.
2. Miks te väidate, et kahefootonilised mikroskoobid ei pea üldiselt olema varustatud ultraviolett-ergastuslaseritega?
Kahefotoni mikroskoopia on fluorestsents-ergastustehnoloogia, mis põhineb kahe fotoni ergastusefektil: fluorestseeruvaid värvimolekule saab ergastada kahe madala energiaga footoni samaaegse neelamise teel (ajavahemik kahe footoni fluorestseeruva molekulini jõudmise vahel on alla 1 femtosekundi ), võib selle ergastusefekt olla samaväärne 1/2 lainepikkusega suure energiaga footoni neelamisega. Näiteks kahe footoni neeldumine punase lainepikkusega võrdub ultraviolettkiirgust neelava molekuliga. Pikalainelised footonid ei imendu rakkudesse kergesti, seega väheneb fototoksilisus elusrakkudele ja väheneb ka fotopleegitamine. Sel viisil ei täida see mitte ainult ultraviolettkiirguse ergastamise funktsiooni, vaid väldib ka proovi ultraviolettvalguse kahjustamist.
3. Mille poolest erineb kahefootonilise mikroskoobi laser?
Kahe footoni neeldumise tõenäosus sõltub sellest, kui täpselt langevad kaks langevat footoni ruumis ja ajas kokku (kaks footonit peavad saabuma 10-18 sekundi jooksul). Kahe fotoni neeldumise ristlõige on väike ja ergastatud on ainult fluorofoorid suure footonivooga piirkondades. Seetõttu on enamik kasutatavatest laseritest titaansafiirlaserid, mis suudavad saavutada pikosekundi- või femtosekundilist skaneerimiskiirust ning millel on väga kõrge tippvõimsus ja madal keskmine võimsus, nii et fotopleegitamist ja fototoksilisust saab vähendada või kõrvaldada. Kõige olulisem on tagada väikeses vahemikus väga kõrge footonite tihedus, mis suudab tagada kahe footoni samaaegse ergastamise.
4. Millised on kahe footoni ergastuse eelised?
1) Suurendage värvaine selektiivsust: konfokaalse süsteemi laseri (Ar, Ar/Kr, HeNe) ergastusvalguse ulatus on 488nm - 647nm. See tähendab katsetamist UV-ergastatud fluorestsentsvärvidega, nt DAPI , Hoeschtiga. Kahe footoni ergastuslainepikkus on kaks korda suurem kui ühefootoni oma, nii et ultraviolettkiirgusega ergastatud värvaineid saab ergastada lähi-infrapunavalgusega.
2) Vähendage fotopleegitamist: fotopleegituse vähenemise tõttu suureneb nende katsete edukus, milles kasutatakse fluorestsentsresonantsenergia ülekande (FRET) CFP/YFP-d.
3) Spetsiaalset objektiivi pole vaja: Riistvaralisest vaatenurgast ei vaja UV-kiirgusega ergastavate värvainete ergastamine lähiinfrapuna valguse lainepikkusega spetsiaalseid UV-optilisi komponente.
4) Parandage signaali-müra suhet: ergastava valguse lainepikkusel ja kiiratava valguse lainepikkusel on suur erinevus, mis parandab signaali-müra suhet.
5) Fookuspunktis paiknev pleegitamine: kuna fluorestsentsi ergastus toimub ainult objektiivi fookuspunktis, pole konfokaalset tihvti vaja. See parandab valguse tuvastamist ja fotopleegitamine toimub ainult fookuspunktis.
6) Kergemini läbitavad proovid: infrapuna lainepikkusega valgust ei hajuta rakud kergesti ja see võib tungida sügavamatesse proovidesse.
5. Võrreldes laserskaneeriva konfokaalse mikroskoopiaga, milline on kahefotoni mikroskoopia suurim edasiminek?
1) Vähendatud fotovalgendamine.
2) Vähendatud fototoksilisus.
3) Seda ei ole lihtne hajutada ja seda on lihtsam tungida paksudesse proovidesse, näiteks ajulõikudesse.
