Nõuded mikroskoopia tavaproovide ettevalmistamiseks
Konfokaalne mikroskoop on epohhiloov kõrgtehnoloogiline uus toode, mis töötati välja 1980ndatel ning see on tänapäeval molekulaarbioloogias ja bioteaduses üks olulisi analüütilisi instrumente. Konfokaalne mikroskoopia põhineb fluorestsentsmikroskoobi pildistamisel, millele on lisatud laserskaneerimisseade, kasutades pilditöötluseks arvutit, et saada fluorestsentskujutisi rakkude või kudede sees olevast mikrostruktuurist ning jälgida muutusi paljude füsioloogiliste signaalimasinate morfoloogias subtsellulaarsel tasemel. Saage võimsaks uurimisvahendiks morfoloogia, molekulaarrakubioloogia, neuroteaduse, farmakoloogia, geneetika ja muudes teadusvaldkondades.
Proovi ettevalmistamine konfokaalseks mikroskoopiaks on kriitiline samm enne tuvastamist. Proovid tuleb märgistada fluorestsentssondidega (ühekordne, kahekordne, kolmekordne).
a
Proovid võivad olla fikseeritud või eluskuded või fikseeritud või elusad kleepuvad kultuurid. Rakke tuleks kasvatada Confocal spetsiaalsetel väikestel kultiveerimisnõudel või katteklaasidel. Peatage rakud, raputage või puistake viilud ja katke katteklaaside kattekilega. Proovi Zda paksus on umbes 1–2 mm, kasutatava katteklaasi paksus peaks olema väiksem kui 0,17 mm ja liugklaasi paksus peaks olema vahemikus 0,8–1,2 mm ja pind on sile, paksus ühtlane ja ilmset häirivat fluorestsentsi ei esine. Kinnituskeskkonda kasutatakse sageli fikseeritud proovide jaoks ja monteerimiseks kasutatakse tavaliselt PBS-is valmistatud glütserooli, mille pH on 8.5-9.
Rutiinse proovi ettevalmistamise nõuded:
1. Värvainete valik
Kuna konfokaalne mikroskoop kasutab valgusallikana ühe lainepikkusega laserit, tuleks fluorestsentsvärvide valikul lähtuda konfokaalse mikroskoobiga varustatud laseri lainepikkusest. Kui ühes proovis on mitu fluorestseeruvat värvainet, tuleks võimalikult palju arvesse võtta ka nende emissiooni lainepikkust. Ristvärviprobleemide vältimiseks ärge kattuge.
2. Proovikandja valik
Üldiselt on konfokaalse mikroskoobi suure võimsusega objektiiviks õlilääts, selle numbriline ava on väike ning läätse ja proovi töökaugus ei tohi olla suurem kui 0,17 mm. Slaidid ja katteklaasid on korras. Kui tegemist on hõljuvate rakkude või suspendeeritud osakestega, võib proovi vaatlemiseks kasutada konfokaalsele mikroskoobile mõeldud Petri tassi.
3. Paigaldusvahendi valik
Kui proovi tuleb vaadelda ainult üks kord ja fluorestsentsi ei saa kergesti kustutada, saate slaidi sulgemiseks valida teatud kontsentratsiooni glütserooli segu. Kui proov tuleb teatud aja jooksul asetada ja seda mitu korda võtta, tuleks fluorestsentssignaalide kadumise vähendamiseks valida fluorestsentsi summutav paigalduskeskkond.
