Konfokaalse mikroskoopia põhimõtted
Konfokaalne mikroskoop on ülitäpne pildistamisvahend, mis tekkis ja arenes välja 1980ndatel ning on oluline teaduslik uurimisvahend submikroniliste struktuuride uurimiseks. Arvutite, pilditöötlustarkvara ja laserite arenguga on ka konfokaalsed mikroskoobid läbinud suure arengu ning neid kasutatakse nüüd laialdaselt bioloogia, mikrosüsteemide ja materjalide mõõtmise valdkonnas. Konfokaalne mikroskoop on uut tüüpi mikroskoop, mis ühendab konfokaalprintsiibi, skaneerimistehnoloogia ja arvutigraafika töötlemise tehnoloogia. Selle peamised eelised on: kõrge külgmine eraldusvõime ja kõrge aksiaalne eraldusvõime ning tõhus hajuva valguse summutamine suure kontrastsusega.
Tüüpiline konfokaalse mikroskoobi seadistus on paigutada mõõdetava objekti fokaaltasandi konjugeeritud tasapinnale kaks väikest auku, millest üks asetatakse valgusallika ette ja teine detektori ette, nagu on näidatud joonisel. 1. Jooniselt on näha, et kui mõõdetud proov on kvaasifookustasandil, on detekteerimisotsa poolt kogutud valgustugevus suurim; kui mõõdetud proov on fookusest väljas, hajub valguspunkt tuvastusotsas ja valguse intensiivsus väheneb kiiresti. Seetõttu saab väljumisava läbida ainult fookustasandil asuvate punktide poolt kiiratav valgus, samas kui fookustasandist väljapoole jäävate punktide poolt kiiratav valgus on väljumisava tasapinnal defokuseeritud ja enamik neist ei pääse läbi kesknõelaava. Seetõttu näib fookustasandil asuv vaatluspunkt hele ja mittevaatluspunkt on taustana must, suurendades kontrasti ja puhastades pilti. Pildistamise käigus on kaks nööpnõela auku konfokaalsed, konfokaalne punkt on tuvastatud punkt ja tasapind, kus tuvastatud punkt asub, on konfokaalne tasand.
Konfokaalses mikroskoopias mängib kriitilist rolli detektori ava suurus. See mõjutab otseselt süsteemi eraldusvõimet ja signaali-müra suhet. Kui auk on liiga suur, ei saavutata konfokaalse tuvastamise efekti, mis mitte ainult ei vähenda süsteemi eraldusvõimet, vaid toob kaasa ka rohkem hajuvat valgust; kui auk on liiga väike, vähendab see tuvastamise efektiivsust ja vähendab mikroskoopilist pilti. heledus. Uuringud on näidanud, et kui nööpnõela läbimõõt on võrdne Airy ketta läbimõõduga, on konfokaalsusnõuded täidetud ja tuvastamise efektiivsus ei vähene oluliselt. Kuna nööpnõela läbimõõt on üldiselt suurusjärgus mikronit, siis kui laserkiire fookuspunkti ja nööpnõela asukoha vahel esineb kõrvalekalle, tekib signaali moonutus. Seetõttu kasutavad konfokaalsed mikroskoobid üldjuhul automaatse teravustamise süsteemi, mis pikendab praktiliselt mõõtmisaega.
Kuna laserkonfokaalne skaneeriv mikroskoop on punktkujutis, siis on objektist kahemõõtmelise kujutise saamiseks vaja kasutada kahemõõtmelist skaneerimist x ja y suunas. Erinevad mikroskoobid kasutavad erinevaid skaneerimismeetodeid:
(1) Objekti skaneerimine. See tähendab, et objekt ise liigub teatud seaduse järgi, samal ajal kui valguskiir jääb muutumatuks. Eelised: stabiilne optiline tee; Puudused: vajalik on suur skaneerimislaud, seega on skannimiskiirus väga piiratud.
(2) Kiirskaneerimissüsteem moodustatakse peegeldava galvanomeetri abil. See tähendab, et skaneeriva galvanomeetri juhtimisega peegeldub fokuseeritud valguspunkt korrapäraselt objekti teatud kihti, et lõpetada kahemõõtmeline skaneerimine. Selle eeliseks on see, et sellel on suur täpsus ja seda kasutatakse sageli suure täpsusega mõõtmiseks. Skannimiskiirus on võrreldes objektide skaneerimisega paranenud, kuid see pole siiski kiire.
(3) Kasutage skaneerimiseks akusto-optilist läbipaindeelementi ja skaneerimine toimub helilaine väljundsageduse muutmisega ja seejärel valguslaine ülekandesuuna muutmisega. Selle silmapaistev eelis on väga kiire skannimiskiirus. Ameerika Ühendriikide välja töötatud skaneerimissüsteem kasutab reaalajas videopiltide genereerimiseks akusto-optilist deflektorit. Kahemõõtmelise kujutise skannimiseks kulub vaid 1/30 sekundit ja see saavutab peaaegu reaalajas väljundi.
(4) Nipkowi ketta skaneerimine. Skannimisprotsess lõpetatakse Nipkowi ketta pööramisega, hoides samal ajal teisi komponente paigal. Seda saab pildistada korraga ja kiirus on väga kiire. Kuna aga pildikiir on teljeväline valgus, tuleb objektiivi teljevälist aberratsiooni korrigeerida ja valgusenergia kasutusmäär on väga madal.
