Mitmefotoni mikroskoopia kujutise tehnoloogia: polarisatsiooni-lahendatud teise-harmoonilise põlvkonna mikroskoopia ja selle pilditöötlus
Mittelineaarsetes optilistes mikroskoopides kasutatakse endogeensete kiuliste struktuuride vaatlemiseks tavaliselt teise harmoonilise põlvkonna (SHG) kujutist ja SHG intensiivsus sõltub suuresti langeva kiire polarisatsioonisuuna ja sihtmolekuli orientatsioonitelje vahelisest suhtelisest nurgast. Seetõttu saab polarisatsioonil põhineva SHG-kujutise (P-SHG) abil saada sihtmolekulide struktuurset teavet, analüüsides SHG signaali intensiivsuse ja langeva kiire polarisatsiooni oleku vahelist funktsionaalset seost. Nüüd kasutatakse seda meditsiinilise ja bioloogilise analüüsi olulise vahendina.
Lihtsaid SHG-pilte saab saada traditsioonilise kahe{0}}fotoni ergastusfluorestsentsmikroskoopia (TPM) abil. Enamik TPM süsteeme kasutab endiselt liikuval peeglil põhinevat ühe kiire skaneerimise meetodit, mille ajaline eraldusvõime sõltub peegli füüsilisest liikumiskiirusest. Kiirema pildistamise saavutamiseks võib TPM-süsteem kasutada ka mitme kiirga skaneerimise meetodit (joonis 1A), millest üks on kasutada pöörlevat ketta skaneerimisseadet. See seade koosneb koaksiaalsest mikroläätsede plaadimängijast ja nööpauguga pöördalusest, kusjuures iga plaadimängija mikroläätsed ja nööpnõelaaugud vastavad -ühele-.
Kui laser läbib mikroobjektiivi pöördaluse, katab lainefront mitu mikroläätse. Erinevad mikroläätsed fokusseerivad lainefrondi erinevad osad erinevatesse positsioonidesse ja läbivad vastavaid auke, moodustades mitu mikrokiirt. Need proovi tabavad mikrokiired võivad samaaegselt ergutada mitut signaali. Need signaalid naasevad mööda mikroskoobisüsteemi ja läbivad uuesti nööpnõela ning lõpuks peegelduvad kahe pöördlaua vahelisest dikroonsest peeglist tuvastusseadmesse. Tavaliselt kasutataval režiimis-lukustatud titaansafiirlaseril valgusallikana on aga ebapiisav energia, mis piirab ergastuskiirte arvu ja annab pöörleva skaneerimisseadme abil väikese efektiivse vaatevälja (FOV) TPM (TPM-SD) jaoks.
Ai Goto jt. mille eesmärk on saavutada TPM-SD-süsteemi kasutades suure -kiire P-SHG-pildistamine suure vaateväljaga (FOV). Seetõttu lisati TPM-SD-süsteemi Yb-põhine suurema tippvõimsusega laserallikas.
See on nende välja töötatud TPM{0}}SD-süsteemi skemaatiline diagramm. Süsteemi valgusallikaks on Yb-põhine laser, mis genereerib femtosekundilisi impulsse kesklainepikkusega 1042 nm, keskmise võimsusega 4 W, impulsi laiusega 300 fs ja kordussagedusega 10 MHz. Süsteem reguleerib esmalt laseri võimsust poollaineplaadi ja Glani laserpolarisaatori kaudu ning seejärel laiendab kiirt läbi kiire laiendaja. Laiendatud kiir sisestatakse pöördlaua skaneerimisüksusesse ja skaneerimisüksusest väljuvad mitmed mikrokiired fokusseeritakse vees sukeldusobjektiivi läätse kaudu proovi mitmesse punkti. Valguskiire polarisatsiooni oleku reguleerimiseks objektiivil asetatakse ergastuskiire optilisele teele poollaineplaat ja veerandlaineplaat.
