Rakuuuringute mikroskoopia klassifikatsioon ja tööpõhimõte
Mikroskoop on rakkude vaatlemise peamine tööriist. Erinevate valgusallikate järgi võib selle jagada kahte kategooriasse: optilised mikroskoobid ja elektronmikroskoobid. Esimene kasutab valgusallikana nähtavat valgust (UV-mikroskoobid kasutavad ultraviolettvalgust), teine aga elektronkiire valgusallikana.
-,Optiline mikroskoop
(1) Tavaline optiline mikroskoop
Tavalised bioloogilised mikroskoobid koosnevad kolmest osast, nimelt: ① valgustussüsteem, sealhulgas valgusallikas ja kondensaator; ② optiline suurendussüsteem, mis koosneb objektiivist ja okulaarist, mis on mikroskoobi põhiosa. Sfäärilise ja kromaatilise aberratsiooni kõrvaldamiseks kasutatakse nii okulaari kui ka objektiivi ③ mehaaniline seade, mida kasutatakse materjali fikseerimiseks ja jälgimise hõlbustamiseks (joonis 2-1).
Seda, kas mikroskoobi pilt on selge, ei määra mitte ainult suurendus, vaid see on seotud ka mikroskoobi eraldusvõimega. Eraldusvõime viitab mikroskoobi (või inimsilma, mis on sihtmärgist 25 cm kaugusel) võimele eristada väikseimat kaugust objektide vahel. Eraldusvõime suuruse määrab Valguse lainepikkuse ja ava suhe ning kandja murdumisnäitaja väljendatakse järgmise valemiga:
Valemis: n=keskkonna murdumisnäitaja;=avanurk (proovi avanemisnurk objektiivi ava suhtes), NA=objektiivi ava (arvuline ava). Objektiivi nurk on alati väiksem kui 180 kraadi, seega peab sina/2 maksimaalne väärtus olema väiksem kui 1.
Optilise läätse valmistamiseks kasutatud klaasi murdumisnäitaja on 1,65–1,78 ja kasutatava kandja murdumisnäitaja on klaasile lähemal, seda parem. Kuivade objektiivide puhul on keskkonnaks õhk ja objektiivi ava suhe on üldiselt 0.05 kuni 0,95; õliläätsede puhul kasutatakse keskmisena seedriõli ja objektiivi ava suhe võib olla 1,5 lähedal.
Tavalise valguse lainepikkus on {{0}}nm, seega ei ole mikroskoobi eraldusvõime väiksem kui 0,2 μm ja inimsilma eraldusvõime on 0,2 mm, seega mikroskoobi üldise disaini maksimaalne suurendus on tavaliselt 1000X.
(2) Fluorestsentsmikroskoopia
Mõned rakkudes olevad ained, näiteks klorofüll, võivad pärast ultraviolettkiirte poolt kiiritamist fluorestseeruda; mõned ained ise ei saa fluorestseeruda, kuid kui need on värvitud fluorestseeruvate värvainete või fluorestseeruvate antikehadega, võivad nad ka ultraviolettkiirtega kiiritades fluorestseeruda ja fluorestsentsmikroskoop (joon. 2-2, 3, 4) on üks tööriistu. selliste ainete kvalitatiivsete ja kvantitatiivsete uuringute jaoks.
Fluorestsentsmikroskoopidel ja tavalistel mikroskoopidel on järgmised erinevused:
1. Valgustuse meetod on tavaliselt epi-illuminatsioon, see tähendab, et valgusallikas projitseeritakse näidisele läbi objektiivi (joonis 2-3);
2. Valgusallikas on ultraviolettvalgus, lainepikkus on lühem ja eraldusvõime kõrgem kui tavalistel mikroskoopidel;
3. Spetsiaalseid filtreid on kaks, valgusallika ees olevat filtrit kasutatakse nähtava valguse väljastamiseks ning okulaari ja objektiivi vahelist ultraviolettkiirgust silmade kaitseks.
(3) Laserskaneeriv konfokaalne mikroskoop
Laserkonfokaalne skaneeriv mikroskoop (laser-konfokaalne skaneeriv mikroskoop, joonis 2-5, 6) kasutab skaneeriva valgusallikana laserit ja skannib kujutist punkt-punkti, joone haaval, pind-pinna haaval ning skaneeriv laser- ja fluorestsentsikogu jagavad objektiivi objektiiv ja objektiivi fookus on Skaneeriva laseri fookuspunkt on ka hetkelise kujutise objekti punkt. Kuna laserkiire lainepikkus on lühike ja kiir väga õhuke, on konfokaalse laserskaneeriva mikroskoobi eraldusvõime suurem, mis on umbes 3 korda suurem kui tavalisel optilisel mikroskoobil. Süsteem fokusseeritakse üks kord ja skaneerimine piirdub proovi ühe tasapinnaga. Kui teravustamissügavus on erinev, on võimalik saada proovi erineva sügavustasemega pilte. See pilditeave salvestatakse arvutisse. Arvutianalüüsi ja simulatsiooni abil saab kuvada rakuproovi kolmemõõtmelise struktuuri.
Konfokaalset laserskaneerivat mikroskoopiat saab kasutada mitte ainult raku morfoloogia jälgimiseks, vaid ka rakusiseste biokeemiliste komponentide kvantitatiivseks analüüsiks, optilise tiheduse statistikaks ja raku morfoloogia mõõtmiseks.
(4) Tumevälja mikroskoop
Tumeväljamikroskoobil (tumevälja mikroskoop, joonis 2-7) on kondensaatori keskel hele leht, nii et valgustusvalgus ei satuks otse inimläätsesse, vaid ainult proovi peegeldub ja hajutatud valgus. on lubatud siseneda objektiivi objektiivi, seega on vaatevälja taust must, Objektide servad on heledad. Seda mikroskoopi kasutades on näha nii väikseid osakesi kui 4-200nm ja eraldusvõime võib olla 50 korda suurem kui tavalistel mikroskoopidel.
(5) Faaskontrastmikroskoop
P. Zernike faasikontrastmikroskoop (faasikontrastmikroskoop, joonis 2-8, 9) leiutati 1932. aastal ja võitis selle eest 1953. aastal Nobeli füüsikaauhinna. Selle mikroskoobi suurim omadus on see, et see suudab jälgida värvimata isendeid ja elusrakke.
Faaskontrastmikroskoopia põhiprintsiip on muuta proovi läbiva nähtava valguse optilise tee erinevus amplituudide erinevuseks, parandades seeläbi erinevate struktuuride kontrastsust ja muutes erinevad struktuurid selgelt nähtavaks. Pärast proovi läbimist valgus murdub, kaldub algsest optilisest teest kõrvale ja hilineb 1/4λ (lainepikkus) võrra. Tugevdage, suurendage või vähendage amplituudi, suurendage kontrasti. Struktuuri poolest on faasikontrastmikroskoobidel kaks eriomadust, mis erinevad tavalistest optilistest mikroskoopidest:
1. Rõngakujuline diafragma asub valgusallika ja kondensaatori vahel ning selle ülesanne on panna kondensaatorit läbiv valgus moodustama õõnsa valguskoonuse ja keskenduma proovile.
2. Faasiplaat (rõngakujuline faasiplaat) lisab objektiivile magneesiumfluoriidiga kaetud faasiplaadi, mis võib otsevalguse või hajutatud valguse faasi edasi lükata 1/4λ võrra. On kahte tüüpi:
①A plussfaasiplaat: otsevalgus viivitatakse 1/4λ võrra. Pärast kahe valguslainete rühma ühendamist liidetakse valguslained kokku ja amplituudi suurendatakse. Proovi struktuur on heledam kui ümbritsev keskkond, moodustades ereda kontrasti (või negatiivse kontrasti).
② B pluss faasiplaat: hajutatud valgus hilineb 1/4λ võrra. Pärast kahe kiirte komplekti ühendamist lahutatakse valguslained ja amplituud muutub väiksemaks, moodustades tumeda kontrasti (või positiivse kontrasti) ja struktuur on ümbritsevast keskkonnast tumedam.
(6) Polariseeriv mikroskoop
Polariseerivat mikroskoopi kasutatakse kahe murdumisega ainete, näiteks filamentide, spindlite, kollageeni, kromosoomide jms tuvastamiseks. Erinevus tavalistest mikroskoopidest seisneb selles, et valgusallika ees on polarisaator (polarisaator), nii et mikroskoopi sisenev valgus on polariseeritud valgus ja analüsaator (polarisaator, mille polarisatsioonisuund on polarisaatoriga risti). objektiivi toru. Selle mikroskoobi lava saab pöörata. Kui lavale asetatakse ühe murdumisvõimega aine, olenemata lava pööramise viisist, kuna kaks polarisaatorit on vertikaalsed, pole mikroskoobis valgust näha ja valgust pole mikroskoobis näha. Kahtmurduvate materjalide sisenemisel suudab pöörlev aste selliseid objekte tuvastada, kuna valgus kaldub selliste materjalide läbimisel kõrvale.
