Mikroskoopilise pildistamise klassiruum丨Fluorestsentsmikroskoopia rakendamine
Täieliku sisemise peegelduse fluorestsentsmikroskoopia (TIRFM) on tehnika, mis kasutab kahe erineva murdumisnäitaja vahel leviva valguskiire tekitatud kaduvat lainet fluorestseeruvalt märgistatud elusrakkude pinna uurimiseks. Praktikas, kui langev laserkiir puutub kokku katteklaasi ja rakke sisaldava vesikeskkonna vahel, peegeldub see kriitilise nurga all (täielik sisepeegeldus). Kuna evanestseeruva laine energia väheneb eksponentsiaalselt katteklaasist kaugusega, ergastab evanestseeruv laine ainult fluorofoori, mis asuvad pinnast 10 nanomeetri raadiuses (vahemikus 10 kuni 200 nanomeetrit), samas kui kaugemal asuvad fluorofoorid on suures osas ergastamata. Mõjutatud. Seega annab TIRFM kõrge signaali katteklaasi lähedal asuvatest fluorofooridest, mis asetsevad väga tumedal taustal, tagades suurepärase signaali-müra suhte. Ergastussügavuse äärmuslik piirang on ideaalne üksikute molekulide või membraani ja organellide koostise uurimiseks katteklaasi pinna lähedal kleepunud rakkudes (vt joonis 8 (e)). Kuna ergastamine piirdub katteklaasi lähedal asuvate õhukeste piirkondadega, on fotopleegitamine ja fototoksilisus piiratud ka nende piirkondadega, muutes TIRFM-i pikaajaliseks vaatluseks üheks kõige kasulikumaks meetodiks. See tehnika on muutunud põhiliseks vahendiks paljude raku- ja molekulaarbioloogia nähtuste uurimisel.
Dekonvolutsioon on algoritm, mida rakendatakse kogu fookusega kujutiste kogumile, mis on saadud piki optilist (Z) telge, et suurendada footonsignaali kujutiste virnas antud pilditasandil või mitmel fookustasandil. Mikroskoobid peavad olema varustatud ülitäpse mootoriga fookusajamiga, et tagada kujutise saamine täpselt määratletud intervallidega proovi fookustasandite vahel. Tüüpilises rakenduses (vt joonis 8(f)) kasutatakse dekonvolutsiooni protsessi, et hägustada ja eemaldada fookusest väljas valgus antud fookustasandilt, kasutades laivälja fluorestsentsi ergastamist ja emissiooni. Kõige keerulisem rakendus on dekonvolutsiooniprotsessi rakendamine kogu pildivirnale, et luua projitseeritud vaateid või 3D-mudeleid. Dekonvolutsiooniks kasutatud laiväljakujutiste komplekt jäädvustab proovi poolt kiiratavate footonite teoreetilise maksimaalse arvu. Dekonvolutsiooniprotsess jaotab fookustasandist kõrgemal ja allpool kiirgavate footonite "hägused" intensiivsused tagasi algtasandile. Seega kasutab dekonvolutsioon peaaegu kõiki saadaolevaid emissiooniintensiivsusi ja tagab optimaalse valguse eelarve, muutes selle tehnika väga valgustundlike proovide jaoks valitud meetodiks.
Resonantsenergia ülekande nähtuse varianti fluorestsentsmikroskoopias, fluorestsents- või Försteri resonantsenergia ülekandel (FRET) kasutatakse kvantitatiivse ajalise ja ruumilise teabe saamiseks valkude, lipiidide, ensüümide ja nukleiinhapete seondumise ja interaktsiooni kohta elusrakkudes. FRET võib kasutada kas konstantse oleku või ajalahutusega tehnikaid, kuid ajalahutusega FRET-pildistamise eeliseks on doonori-aktseptori kauguste täpsem kaardistamine. FRET-pildistamiseks saab kasutada tavalist laia väljaga fluorestsentsmikroskoopi, mis on varustatud sobivate ergastus- ja emissioonifiltritega ning tundliku kaameraga. Praegu kasutatakse rakubioloogias laialdaselt biosensoreid, mis asetavad keskkonnatundliku valgu või peptiidi kahe FRET-iga rakendatava fluorestseeruva valgu vahele. Neid sonde saab hõlpsasti pildistada laia väljaga fluorestsentsmikroskoopia abil, kasutades sensibiliseeritud emissiooni FRET tehnikaid koos ratiomeetrilise analüüsiga. Lisaks võivad spektraalkujutised ja lineaarne lahtisegamine laserskaneeriva konfokaalse mikroskoopia abil aidata jälgida FRET-i nähtusi biosensorites ja muudes fluorestsentsvalgurakendustes.
Fluorestsentsi eluiga pildimikroskoopia (FLIM) on keerukas tehnika, mis suudab samaaegselt salvestada fluorestsentsi eluiga ja fluorofoori ruumilist asukohta pildi igas kohas. See meetod pakub mehhanismi selliste keskkonnaparameetrite uurimiseks nagu pH, ioonide kontsentratsioon, lahusti polaarsus, mittekovalentsed interaktsioonid, viskoossus ja hapniku pinge üksikutes elusrakkudes ning esitab andmed ruumilistes ja ajalistes massiivides. Ergastatud oleku eluea FLIM-i mõõtmised nanosekundi skaalal ei sõltu kohalikest fluorofooride kontsentratsioonidest, fotovalgenduse efektidest ja tee pikkusest (proovi paksusest), kuid on tundlikud ergastatud olekureaktsioonide, näiteks resonantsi energiaülekande suhtes. Tegelikult peetakse FLIM-i kombineerimist FRET-iga, jälgides fluorestseeruvate doonorite eluea muutusi enne ja pärast resonantsenergia ülekannet, üheks parimaks viisiks selle nähtuse uurimiseks.
Fluorestseeruvalt märgistatud makromolekulide ja väikeste fluorofooride liikuvust (risti difusioonikoefitsienti) saab määrata fluorestsentsi taastamisega pärast fotovalgenduse (FRAP) tehnikat. FRAP-is valgustatakse väga väikest valitud ala (läbimõõt mõne mikromeetriga) intensiivselt, tavaliselt laseriga, et tekitada selles piirkonnas fluorofoori täielik fotopleegitamine. Tulemuseks on fluorestsentsi dramaatiline vähenemine või hävitamine. Pärast fotovalgendusimpulssi jälgiti fluorestsentsi intensiivsuse taastumise kiirust ja ulatust pleegitatud piirkondades aja funktsioonina madala ergastuse intensiivsusega, et saada teavet fluorofoori taasasustamise ja taastumise kineetika kohta (joonis 9). FRAP viiakse tavaliselt läbi EGFP või muude fluorestseeruvate valkude abil. Seotud fotoaktiveerimistehnikad põhinevad spetsiaalsetel sünteetilistel puuris olevatel fluorofooridel või sarnaselt funktsionaalsetel fluorestseeruvatel valkudel, mida saab aktiveerida lühikeste UV- või violetsete impulssidega. Fotoaktiveerimist ja FRAP-i saab kasutada täiendavate meetoditena liikuvusparameetrite määramiseks.
FRAP-iga seotud tehnikas, mida nimetatakse fluorestsentsi kadumiseks pärast fotopleegitamist (FLIP), läbib elusraku määratletud fluorestsentspiirkond intensiivse kiiritamise teel korduva fotopleegitamise. Kui kõik fluorofoorid suudaksid mõõdetud aja jooksul valgusvalgendatud piirkonda difundeeruda, kaoks see fluorestsentssignaali täielikult kogu rakus. Arvutades kiiruse, millega fluorestsents kaob kogu rakust, saab määrata sihtmärgiks oleva fluorofoori difusioonilise liikuvuse. Lisaks saab FLIP hõlpsasti tuvastada rakkude üksikute sektsioonide vaheliste difusioonitõkete asukoha ja olemuse, näiteks barjääri neuroni soma ja aksoni vahel.
Fluorestsentskorrelatsioonspektroskoopia (FCS), mida kasutatakse peamiselt laserskaneerivas konfokaalses mikroskoopias või multifotonmikroskoopias, on meetod, mis on loodud kineetilise teabe, näiteks keemilise reaktsiooni kiiruste, difusioonikoefitsientide, molekulmassi, voolukiiruse ja agregatsiooni määramiseks. FCS-is valgustatakse väikest mahtu (ligikaudu üks femtomeeter; laseri difraktsioonipiiranguga fookus) fokuseeritud laserkiirega, et registreerida fluorestsentsmolekulide dünaamikast põhjustatud autofluorestsentsi intensiivsuse kõikumised aja funktsioonina fluorestsentsiga hõivatud ruumalas. molekulid (joonis 10). Suhteliselt väikesed fluorofoorid hajuvad valgustatud ruumalas kiiresti, tekitades juhusliku intensiivsusega lühikesi purskeid. Seevastu suuremad kompleksid (makromolekulidega seotud fluorofoorid) liiguvad aeglasemalt, tekitades pikemaid ja püsivamaid ajast sõltuvaid fluorestsentsi intensiivsuse mustreid.
Kui fluorestsentsmärgistatud struktuurid on tihedalt pakitud ja kattuvad elusrakkude teatud piirkondades, on nende dünaamikat ja ruumilist jaotust raske analüüsida. Fluorestsentspunktmikroskoopia (FSM) on peaaegu kõigi pildistamisviisidega ühilduv tehnika, mis kasutab ära fluorestsentsmärgistatud subühikute väga madalaid kontsentratsioone, vähendab fookusest väljas fluorestsentsi ning parandab märgistatud struktuuride nähtavust ja nende dünaamikat paksudes piirkondades. FSM-id rakendatakse nii, et märgistatakse vaid murdosa kogu huvipakkuvast struktuurist. Selles mõttes sarnaneb FSM FCS-i teostamisega kogu vaatevälja ulatuses, kuigi see paneb rohkem rõhku pigem ruumilistele mustritele kui kvantitatiivsele ajalisele analüüsile. Fluorestsentspunktmikroskoopia on eriti kasulik tsütoskeleti elementide, nagu aktiini ja mikrotuubulite liikuvuse ja agregatsiooni määramisel hüperaktiivsetes rakkudes.
Stimuleeritud emissioonikao mikroskoopia (STED) on arenev ülieraldusvõimega tehnika, mille ruumiline eraldusvõime ületab palju difraktsioonipiiri, kasutades rõngakujulist ammendunud valgust, et ümbritseda väiksemat ergastusvalgusvihku, et saada teljel sub-50 nm. resolutsioon. Meetod tugineb fluorofooride ergastamisele sünkroniseeritud laserimpulssidega ja ruumiliselt koordineeritud ümmarguste STED-impulssidega, mis kahandavad kiirgavat valgust, vähendades ergastatud molekulide fluorestsentsi laserskaneerimise fookuse ümber. Laigu perifeerias tekkiv fluorestsents on alla surutud, kuid mitte laigu keskel, vähendades seega oluliselt fluorestseeruva laigu suurust ja suurendades vastavalt oluliselt eraldusvõimet. STED on osutunud kasulikuks vahendiks elusrakkude kõrge eraldusvõimega tuvastamiseks. Lähitulevikus saavad elusrakkude pildistamise põhitööriistadeks ka teised esilekerkivad ülieraldusvõimega tehnikad, nagu fotoaktiveeritud lokaliseerimismikroskoopia (PALM) ja struktureeritud valguse valgustusmikroskoopia (SIM).
Geneetiliselt kodeeritud fluorestseeruvate valkude ja arenenud sünteetiliste fluorofooride sagenev kasutamine elusrakkude pildistamiseks avab ukse uutele optilistele viisidele ajalise dünaamika ja ruumiliste suhete jälgimiseks. Mikroskoopidel on nüüd täielik komplekt tööriistu, et jälgida ja salvestada pildiandmete andmeid rakuprotsesside kohta, mis toimuvad laias vahemikus ja mitme eraldusvõimega. Aeglasemaid sündmusi saab hõlpsasti jälgida ja salvestada laserskaneeriva konfokaalse mikroskoopia abil, samas kui kiiremaid kineetilisi sündmusi saab saada pöörleva ketta tehnoloogia abil. Lisaks võimaldab multifotonmikroskoopia paksude kudede sügavat pildistamist ja täieliku sisemise peegelduse tehnikad võimaldavad membraanipindade sondeerimist konfokaalse täpsusega. Täiustatud fluorestsentsmeetodeid, nagu FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM ja STED, saab kasutada valgu-valgu interaktsioonide jälgimiseks eraldusvõimega, mis on sageli paremad kui difraktsioonipiir. Fluorofoori-, mikroskoobi- ja detektoritehnoloogia edusammudega tuuakse "mikroskoobi alla" laiem maailm.
