Mitmefotoonsete mikroskoopide fookussügavuse suurendamise meetodid
Kahe{0}}fotoonlaseriga skaneeriva mikroskoobi ja kaltsiumindikaatori kombinatsioon on in vivo neuronaalsete signaalide tuvastamise kuldstandard. Närvivõrkude neuronid on jaotatud kolmemõõtmelises ruumis ja nende aktiivsuse dünaamika jälgimine nõuab viisi, kuidas kiiresti helitugevuse kuvamise kiirust parandada. Kui aga kasutada suure arvu kujutiste jäädvustamiseks võrega skaneerivat multifotoni mikroskoopi, siis kui suurema külgeraldusvõime saavutamiseks kasutatakse suure numbrilise ava (NA) objektiivi, on tulemuseks väiksem fookussügavus. Mahukujutise saamiseks väikesel fookussügavusel,
On vaja läbi viia Z-telje skaneerimine teatud vahenditega, pildistades palju tasapindu iga fookustasandi skaneerimisega, mis piirab oluliselt pildistamise kiirust. Kui aksiaalset kujutise teavet saab ohverdada ja helitugevuse skannimist on võimalik saavutada ühe külgmise skaneerimisega, suurendades fookuse sügavust, see tähendab, et helitugevuse teave projitseeritakse ühele 2D-pildile, saab pildistamise kiirust oluliselt parandada. Seda nimetatakse laiendatud fookuse sügavuse (EDF) pildistamiseks, mis on eriti kasulik hõredate populatsioonistruktuuride kuvamiseks, mis nõuavad kõrget ajalist eraldusvõimet, näiteks neuronaalse aktiivsuse funktsionaalne pildistamine.
Mikroskoobi aksiaalne ja külgmine eraldusvõime määratakse objektiiviläätse numbrilise ava (NA) järgi. Kõrge NA võib maksimeerida aksiaalset ja külgsuunalist eraldusvõimet ning kogutud valguse hulka; Madalam NA toob kaasa madalama aksiaalse eraldusvõime, st pikema fookuse sügavuse, kuid samal ajal ohverdab külgmise eraldusvõime ja valguse kogumise efektiivsuse. Järgmisena tutvustatav fookussügavuse suurendamise meetod võimaldab seda saavutada, säilitades samal ajal kõrge külgeraldusvõime ja piisava valgusvoo.
Ruumilise valguse modulaatorite kasutamine sihvakate Besseli valguskiirte tekitamiseks võib saavutada EDF-kujutise, kuid ruumilised valgusmodulaatorid on mahukad ja neid on keeruline kitsastes mikroskoobiruumides ühilduda; Seevastu telgpüramiididel põhinevad Besseli moodulid on odavad ja kompaktsed, kuid suudavad genereerida vaid fikseeritud sügavusega fookuspunkte ega sobi erinevateks katseteks, mis nõuavad pidevat fookussügavuse muutmist. Selle probleemi lahendamiseks koostasid 2018. aastal RONGWEN LU jt. demonstreeris aksikoonil põhinevat Besseli moodulit, milles Besseli fookuspunkti aksiaalse pikkuse pidevaks reguleerimiseks tuleb piki optilist telge tõlkida ainult üks objektiiv.
Joonis 1 a) Besseli mooduli seadmeskeem; (b) Punktide hajumise funktsiooni mõõdeti eksperimentaalselt, kui D oli vastavalt -12 mm, 0 mm ja 12 mm; c) Seos külgmise täislaiuse poole maksimumiga, d) teljelise täislaiuse poole maksimumiga, e) tippsignaali ja f) objektiivi taga oleva optilise võimsuse vahel L2 nihkega D
Moodulseade muutuva pikkusega Besseli fookuspunkti moodustamiseks on näidatud joonisel 1a. Langev Gaussi kiir kujundatakse pärast telje ja läätse L1 läbimist ringikujuliseks kiireks. Järgnev ümmarguse avaga mask võib blokeerida aksikooni defektidest põhjustatud hajutatud valgust, kujundades seeläbi kahe -fotoni ergastuspunkti levimisfunktsiooni aksiaalset jaotust. Seejärel projitseeritakse valguskiir läätsede L2 ja L3 abil galvanomeetrile ning jõuab seejärel läbi läätsede L4 ja L5 objektiivi tagumise fookustasandini.
Need konstruktsioonid on sarnased traditsioonilistele püramiidipõhistele moodulitele, selle erinevusega, et liigutades L2 või L3 piki optilist telge, saab Besseli fookuse aksiaalset pikkust pidevalt reguleerida. Joonisel 1b on näidatud aksiaalpunktide hajutuse funktsioonid D väärtuste korral -12 mm, 0 mm ja 12 mm, kusjuures aksiaalne täislaius on poole maksimumi juures 39? m,24? M ja 14? m. Nagu on näidatud joonisel fig 1c-f, võib objektiivi L2 liigutamine vasakult paremale pidevalt muuta täislaiust poole maksimumiga nii risti- kui ka teljesuunas, mis tähendab, et fookuse sügavust saab pidevalt muuta. Vektori difraktsiooni teoorial põhinevad arvsimulatsiooni tulemused on eksperimentaalsete andmetega hästi kooskõlas. Joonisel 2 on näidatud erineva suurusega rõngakujuliste maskide korrigeerimise mõju aksikoondefektidele. On leitud, et õhemad rõngakujulised maskid suudavad paremini optimeerida Besseli kiire väljundi aksiaalset intensiivsuse jaotust, kuid samal ajal põhjustavad need ka suuremat võimsuskadu.
