Madala hinnaga fluorestsentsi ja ereda väljaga mikroskoobi disain
Fluorestsentsmikroskoopia on meetod, mida kasutatakse selle visualiseerimiseks
Selles juhendis käsitlen fluorestsentsmikroskoopia põhitõdesid ja kolme erinevat odavat fluorestsentsmikroskoopi. Need süsteemid maksavad tavaliselt tuhandeid dollareid, kuid hiljuti on tehtud jõupingutusi nende kättesaadavamaks muutmiseks. Siin esitatud kujundused kasutavad nutitelefoni, dSLR-i ja USB-mikroskoopi. Kõiki neid kujundusi saab kasutada ka eredavälja mikroskoopidena.
1. samm: fluorestsentsmikroskoopia ülevaade
Fluorestsentsmikroskoopia põhimõistete mõistmiseks kujutage ette öist tihedat metsa, kus on puid, loomi, põõsaid ja muid elavaid metsi. Kui valgustate tõrvikuga metsa, näete kõiki neid struktuure ja teil on raske konkreetseid loomi või taimi visualiseerida. Oletame, et teid huvitab ainult mustikapõõsaste nägemine metsas. Selleks treenite tulikärbst meelitama ainult mustikapõõsaste poole, nii et metsa vaadates süttivad ainult mustikapõõsad. Võiks öelda, et tulikärbeste abil märgitakse mustikapõõsaid, et metsas oleks näha mustikaehitisi.
Selles analoogias esindab mets kogu proovi, mustikapõõsad kujutavad struktuure, mida soovite visualiseerida (nt konkreetsed rakud või subtsellulaarsed organellid), ja tulikärbsed on fluorestseeruvad ühendid. Ainuüksi taskulambi valgustamine ilma tulikärbesteta on sarnane ereda välja mikroskoopiaga.
Järgmine samm on mõista fluorestseeruvate ühendite (tuntud ka kui fluorofoorid) põhifunktsiooni. Fluorofoorid on tegelikult väikesed objektid (nanoskaala), mis on loodud proovis konkreetsete struktuuride ühendamiseks. Nad neelavad kitsas vahemikus valguse lainepikkusi ja kiirgavad uuesti välja teise lainepikkuse valguse. Näiteks võib fluorofoor neelata sinist valgust (st fluorofoor ergastatakse sinise valgusega) ja seejärel kiirata uuesti rohelist valgust. Tavaliselt võetakse see kokku ergastus- ja emissioonispektrites (ülal). Need diagrammid näitavad fluorofoori neeldunud valguse lainepikkust ja fluorofoori poolt kiiratava valguse lainepikkust.
Mikroskoobi disain on väga sarnane tavalise ereda väljaga mikroskoobi omaga, millel on kaks peamist erinevust. Esiteks peab proovi valgustav valgus olema lainepikkusel, mis ergastab fluorofoori (ülaltoodud näite puhul on valgus sinine). Teiseks peab mikroskoop koguma ainult kiiratavat valgust (rohelist valgust), blokeerides samal ajal sinise valguse. Selle põhjuseks on asjaolu, et sinine valgus on kõikjal, kuid roheline tuli tuleb ainult proovi konkreetsetest struktuuridest. Sinise valguse blokeerimiseks on mikroskoopidel tavaliselt midagi, mida nimetatakse pikapääsfiltriks, mis laseb rohelist valgust läbi ilma sinise valguseta. Igal kaugpääsfiltril on piirlainepikkus. Kui valguse lainepikkus on suurem kui piirlainepikkus, võib see läbida filtri. Sellest ka nimi "pikk pass". Lühemad lainepikkused on blokeeritud.
2. samm: mikroskoobi modelleerimine optilise optikaga
See on täiendav samm mikroskoobi disaini põhiprintsiipide juurde. Fluorestsentsmikroskoopi pole vaja ehitada, nii et võite selle vahele jätta, kui te ei soovi optikasse süveneda.
Kiiroptika abil saab modelleerida nii heledavälja kui ka fluorestsentsmikroskoope. Kiiroptika põhieeldus on, et valgus käitub sarnaselt valgusallikast eemalduva valgusega. Kui vaatate ruumis ringi, näete aknast väljas oleva päikesevalguse või lambipirni valgust. Seejärel neelavad või peegeldavad valgust ruumis olevad objektid. Osa peegeldunud valgusest suunab selle teie silmade poole. Kui objekt on valgustatud, võite ette kujutada, et objekti iga punkt kiirgab valgust kõigis suundades (ülal). Objektiiv, nagu ka meie silmade lääts, teravustab valguse punkti, et me näeksime objekti. Ilma läätseta liigub valgus edasi väljapoole ega moodusta pilti.
Kuidas siis teha optilisi süsteeme, mis suurendavad väikeseid objekte? Disaini mõistmiseks peate teadma ainult kahte võrrandit: õhukese läätse kujutise ja suurendusvõrrandid:
1/f=1/si + 1/nii
M=-si/nii
f on objektiivi fookuskaugus. Lühem fookuskaugus tähendab, et objektiivil on suurem teravustamisvõime.
Sama kehtib ka objekti kauguse kohta; objektiivi ja objekti (nt puu) vaheline kaugus.
si on pildi kaugus; objektiivi vaheline kaugus ja kujutise moodustamise koht
M on suurendus; kui suur on kujutis objekti suhtes. Mikroskoopide puhul tahame suurendada suurendust.
Õhuke läätse võrrandi täieliku õpetuse saamiseks vaadake seda Khan Academia videot. Ülaltoodud gifis on näha, et vahemaa, milleni objekt objektiivile lähemale liigub, suurendab pildi kaugust, mis suurendab suurendust. Vertikaalne joon kahe noolega tähistab objektiivi.
