Konfokaalne lasermikroskoopia – funktsioonid ja rakendused
Laser-skaneeriv konfokaalne mikroskoopia (LSCM) on teatud tüüpi mikroskoop, mis põhineb konjugaatfookustehnoloogial, st laservalgusallikas, mõõdetav proov ja detektor on kõik omavahel konjugeeritud asendis.
Fundamentaalne
Üldmikroskoobis eraldatakse vaatluse kujutistasand külgnevast telgtasapinnast, langedes kokku objektiivi fookustasandi detektoriga, samas kui konfokaalmikroskoobis kasutatakse proovi valgustamiseks difraktsioonipiiranguga valguspunkti ja A. tihvti kasutatakse kogutud valgusteel valguspunkti konjugeeritud fookuses hajuva valguse filtreerimiseks, et luua isolatsiooniefekt ja seeläbi parandada eraldusvõimet.
Pildistamise funktsioonid
Optilise sektsiooni skaneerimise pildistamine
Veel üks laserskaneeriva konfokaalse mikroskoopia omadus on see, et see on skaneeriva kujutise tehnoloogia. Traditsiooniline laia väljaga valgustustehnoloogia valgustab kogu näidist, nii et pilti saab jäädvustada otse palja silmaga või detektoriga, kuid LSCM kasutab skaneerimiseks ja pildistamiseks kiirt või proovi läbib mitu fokusseeritud kiirt. Saadud kujutist nimetatakse optiliseks lõiguks. Järgnevalt on näidatud erinevus traditsioonilise laia väljaga valgustusmeetodi ja laserskaneeriva konfokaalse valgustusmeetodi vahel.
Seetõttu on tänapäevase konfokaalse mikroskoobi tegelik töömeetod selline, nagu on näidatud alloleval joonisel. Laseri poolt kiiratav ergastusvalgus läbib dikroonse peegli ja skaneeritakse proovi x- ja y-suunas läbi galvanomeetrite paari. Proovi ergastus (või peegeldus) on Valgus siseneb PMT detektorisse läbi tihvtiaugu ja salvestatakse ning salvestatud skannitud kujutis rekonstrueeritakse arvuti abil, et rekonstrueerida tegelik proovipilt.
Looge "z-stack" pilte erinevatel fookustasanditel
Ainult konjugeeritud proovikihist tagasi peegelduv valgus võib läbida kogumisvalguse tee väikese augu ja ülejäänud ebaolulised proovikihi peegeldused blokeeritakse väikese auguga. See võib eraldusvõimet oluliselt parandada. Sama paksu proovi mitmemõõtmelise fluorestsentsmikroskoopia ja konfokaalse mikroskoopia kõrvuti võrdlus. Kui pildiseeria tehakse erinevatel fookustasanditel, saab luua kujutisi, mida tavaliselt nimetatakse "z-virnadeks", mis illustreerivad konfokaalse mikroskoopia pakutavat eraldusvõime ja kontrasti suurenemist ning nende suurenemise põhjuseid. On näha, et virna ülaosas asuva kujutise uurimine koe kohal asuva kujutise tasapinnaga paljastab fluorestsentspildil suure hulga hajutatud valgust, samas kui konfokaalne mikroskoopia pilt näib olevat must. See aksiaalse polüesterstaapelkiudude vähenemine põhjustab otseselt z-virna keskel asuvas optilises liideses täheldatud eraldusvõime erinevust.
Eraldusvõime on laiväljavalgustusega võrreldes tunduvalt parem
Fluorestsentsmikroskoopias kirjeldatakse ühest punktist kiirgava valguse intensiivsust punkti hajutamise funktsiooniga (PSF) ja selle muster on Airy ketas. Fluorestsentssüsteemi lahutusvõimet saab kirjeldada Airy ketta raadiusega, mida saab kirjeldada Objektiiviläätse numbriline ava ja ergastusvalguse lainepikkus määravad
