Konfokaalse fluorestsentsmikroskoopiaga seotud teadmised
Konfokaalse fluorestsentsmikroskoopia põhiprintsiip on kasutada proovi kiiritamiseks punktvalgusallikat, moodustades fookustasandil täpselt määratletud väikese täpi. Objektiivi lääts kogub täpi poolt kiiritatud fluorestsentsi ja saadetakse tagasi kahesuunalisest värvipeeglist koosnevasse spektrofotomeetrisse mööda esialgset kiiritusrada. Spektrofotomeeter saadab fluorestsentsi otse detektorisse. Valgusallika ja detektori ees on kaks auku, mida nimetatakse vastavalt valgustusavadeks ja tuvastusnõelaauguks. Nende kahe geomeetrilised mõõtmed on ühtsed, umbes 100-200nm; Võrreldes fookustasandi valguspunktiga on need kaks konjugeeritud, mis tähendab, et valguspunkt läbib läätsede seeriat ja võib lõpuks fokuseerida nii valgustusnõelaaugule kui ka tuvastusnõelaaugule. Sel viisil võib fookustasandi valgus läheneda tuvastusava piiresse, samas kui fookustasandist ülevalt või altpoolt tulev hajutatud valgus blokeeritakse väljaspool tuvastusava ja seda ei saa pildistada. Skaneerides laseriga proovi punkt-punktilt, saab fotokordisti toru pärast nööpnõela avastamist valguspunktist punkt-punktilt ka vastava konfokaalse kujutise, mis muundatakse digitaalseks signaaliks ja edastatakse arvutisse. Lõpuks sünteesitakse ekraanile kogu fookustasandi selge konfokaalne kujutis.
Iga fokaaltasandi kujutis on tegelikult näidise optiline ristlõige, millel on alati teatud paksus, mida tuntakse ka optilise õhukese lõiguna. Tulenevalt asjaolust, et valguse intensiivsus fookuspunktis on palju suurem kui mittefookuspunktis ja mittefokaaltasandiline valgus filtreeritakse välja aukudega, on konfokaalse süsteemi teravussügavus ligikaudu null. Skaneerimine mööda Z-telje suunda võib saavutada optilise tomograafia, moodustades vaadeldava proovi fookuspunktis kahemõõtmelise optilise lõigu. Kombineerides XY tasapinna (fokaaltasandi) skaneerimise Z-telje (optilise telje) skaneerimisega, saab proovist kolmemõõtmelise kujutise saada kahemõõtmeliste kujutiste pidevate kihtide kogumisel ja nende töötlemisel spetsiaalse arvutitarkvaraga.
Tuvastusava ja valgusallika tihvtiauk on alati fokusseeritud samasse punkti, nii et väljaspool teravustamistasandit ergastav fluorestsents ei pääse tuvastamise auku.
Laserkonfokaalse mikroskoopia tööpõhimõtte lihtne väljendus seisneb selles, et see kasutab valgusallikana laserit ning lisab traditsioonilise fluorestsentsmikroskoopia kujutise alusel laserskaneerimisseadme ja konjugaatfookusseadme. See on arvuti poolt juhitav süsteem digitaalsete kujutiste hankimiseks ja töötlemiseks.
