Sissejuhatus fluorestsentsmikroskoopiasse
Fluorestsentsmikroskoopia eesmärk on kiiritada fluorestseiiniga värvitud objekti lühikese lainepikkusega valgusega, nii et see ergastatakse pika lainepikkusega fluorestsentsi tekitamiseks ja seejärel jälgitakse. Fluorestsentsmikroskoobis tuleb fluorestsentsi tekitamiseks valida konkreetse lainepikkusega ergastusvalgus proovi valgustusvalguse hulgast ning seejärel eraldada fluorestsents ergastusvalguse ja fluorestsentsi segavalgusest vaatlemiseks. Seetõttu on filtrisüsteemil konkreetse lainepikkuse valimisel äärmiselt oluline roll. Fluorestsentsmikroskoope kasutatakse laialdaselt bioloogias, meditsiinis ja muudes valdkondades.
1. Fluorestsentsmikroskoobi põhikomponendid:
(A) Valgusallikas: valgusallikas kiirgab erineva lainepikkusega valgust (ultravioletsest infrapunani). a
(B) Ergastusfiltri valgusallikas: läbi teatud lainepikkusega valguse, mis võib põhjustada proovi fluorestsentsi tekitamist, blokeerides samal ajal valguse, mis pole erutava fluorestsentsi jaoks kasutu. a
(C) Fluorestseeruvad proovid: üldiselt värvitud fluorestseeruvate pigmentidega. a
(D) Blokeeriv filter: blokeerige ergastav valgus, mida proov ei neela, ja edastab selektiivselt fluorestsentsi ning mõned lainepikkused edastatakse fluorestsentsis valikuliselt.
a
2. Fluorestsentsmikroskoopide klassifikatsioon:
Fluorestsentsmikroskoobid jagunevad üldiselt kahte tüüpi: transmissioon ja epiemissioon:
a. Edastamise tüüp: ergastusvalgus tuleb kontrollitava objekti põhjast ja kondensaator on tumeda välja kondensaator, nii et ergastav valgus ei sisene objektiivi, vaid fluorestsents siseneb objektiivi. Madalatel suurendustel on see hele, kuid suure suurenduse korral tume. Õlikümbluses ja tsentreerimises on raske töötada. Valgusvahemikku on eriti keeruline määrata madalal suurendusel, kuid see võib saada väga tumeda vaatevälja tausta. Edastustüüpi ei kasutata läbipaistmatute objektide puhul. a
b. Epi-tüüp: ülekandetüüp on praegu peaaegu kõrvaldatud. Enamik uutest fluorestsentsmikroskoopidest on epi-tüüpi. Valgusallikas tuleb kontrollitava objekti kohalt ning optilisel teel on kiirjagur, seega sobib nii läbipaistvatele kui ka läbipaistmatutele kontrollitavatele objektidele. Kuna objektiiv toimib kondensaatorläätsena, pole seda mitte ainult lihtne kasutada, vaid see võimaldab saavutada ka kogu vaatevälja ühtlase valgustuse alates väikesest suurendusest kuni suure suurenduseni. a
a
3. Ettevaatusabinõud fluoroskoopiaks
a. Ergastusvalguse pikaajaline kiiritamine põhjustab fluorestsentsi nõrgenemist ja summutamist, seega lühendage vaatlusaega nii palju kui võimalik ja kasutage ergutusvalguse katmiseks deflektorit, kui ajutiselt ei vaatle. a
b. Kui jälgite õlikümblusläätsega, kasutage "mittefluorestseeruvat õli". a
c. Fluorestsents on peaaegu alati nõrk ja seda tuleks läbi viia pimedas ruumis. a
d. Parim on paigaldada toiteallikasse pinge stabilisaator, vastasel juhul ei vähenda ebastabiilne pinge mitte ainult elavhõbedalambi eluiga, vaid mõjutab ka mikroskoobi kontrollimise mõju. a
a
4. Fluorestsentsmikroskoopia kasutamine
1. Fluorestsentsmikroskoobi proovide ettevalmistamise nõuded
a. Klaasist liumägi
Klaasklaasi paksus peaks olema vahemikus 0,8 kuni 1,2 mm. Liiga paks alusklaas neelab ühelt poolt rohkem valgust ja teisest küljest ei saa ergastavat valgust katsekehale kontsentreerida. Slaidid peavad olema siledad, ühtlase paksusega ja ilma ilmse autofluorestsentsita. Mõnikord kasutatakse kvartsklaasist slaide. a
b. Katteklaas
Katteklaasi paksus on umbes 0,17 mm, sile. Ergastusvalguse tugevdamiseks võib kasutada ka kuiva katteklaasi, mis on spetsiaalne katteklaas, mis on kaetud mitme kihi ainetega (nt magneesiumfluoriid), millel on erineva lainepikkusega valguse erinev interferents, mis võib fluorestsents läheb sujuvalt. Ergastusvalgus lastakse läbi ja peegeldunud ergastusvalgus ergastab proovi. a
c. Näidis
Koeviilud või muud proovid ei tohiks olla liiga paksud. Kui see on liiga paks, kulub suurem osa ergastusvalgusest proovi alumises osas, samas kui objektiiviläätse poolt otse vaadeldav ülemine osa ei saa täielikult ergastuda. Lisaks katavad rakud või lisandid, mis mõjutavad otsust. a
d. Paigaldusvahend
Tavaliselt kasutatakse kinnitusainena glütseriini, millel ei tohi olla autofluorestsentsi, see ei tohi olla värvitu ja läbipaistev ning fluorestsentsi heledus on heledam pH väärtusel 8.5-9.5 ja seda ei ole lihtne kiiresti tuhmuda. Seetõttu kasutatakse kinnitusainena tavaliselt võrdset segu glütseroolist ja 0,5 mol/L karbonaadi puhverlahusest, mille pH on 9.0 kuni 9,5. a
e. peegliõli
Tavaliselt tuleb proovide vaatlemisel tumevälja fluorestsentsmikroskoobi ja õliimmersioon-immersioonobjektiividega kasutada immersioonõli. Parim on kasutada spetsiaalset mittefluorestseeruvat peegliõli, mida saab samuti asendada eelpool mainitud glütseriiniga, samuti võib kasutada vedelat parafiini, kuid murdumisnäitaja on madal, mis mõjutab veidi pildikvaliteeti.
