Kui palju te teate fluorestsentsmikroskoopiast?
Fluorestsentsmikroskoobid kasutavad ergastava valgusallikana üldiselt suure intensiivsusega elavhõbedalampe. Filtreid kasutatakse soovimatu valguse välja filtreerimiseks, jättes alles vaid kõrge intensiivsusega puhta valguse, mis ergutab fluorofoori. Pärast seda, kui monokromaatiline valgus kiiritab proovi läbi objektiiviläätse, ergastatakse proovi valguse kiirgamiseks (fluorestsents) ja nii fluorestsents kui ka ergastusvalgus naasevad mööda objektiiviläätse optilist rada. Sel juhul on ergastava valguse filtreerimiseks vajalik dikroiline peegel. , lastes läbi näha ainult fluorestsentsi, mida vajame.
See fluorestsents jõuab okulaarini mööda mikroskoobi valgusteed ja seejärel meie silmadesse, kus näeme fluorofoori kiirgavat fluorestsentsi.
Fluorestsentsmikroskoobi eelkontroll ja reguleerimine:
(1) Enne iga fluorestsentsvaatlust on vaja regulaarselt kontrollida fluorestsentsseadme hõõgniidi joondust, optilise tee fookust, ava diafragma ja väljadiafragma sätteid.
(2) Kas muundurisse on paigaldatud nõutav fluorestsents-ergastus-/emissioonifiltri komplekt, kas fluorestsentsmikroskoobi objektiiv on õigesti konfigureeritud ning eemaldage objektiivi esiläätse õliplekid ja tolm.
(3) Kui samaaegselt teostatakse läbiva valguse faasikontrastsuse vaatlust, on vaja kontrollida kondensaatori keskpunkti ja objektiivi vastas oleva faasikontrastrõnga konjugatsiooni.
(4) Kontrollige, kas proovikandja (klaas, katteklaas ja muud nõud) on kaetud vedeliku või tolmuga ning kas paksus jääb objektiivi kalibreeritud töökauguse vahemikku. Viilutatud proov ei tohiks olla liiga paks, eelistatavalt väiksem kui 10 μm või sellega võrdne.
(5) Kuna valgusallikas sisaldab ultraviolettkiiri, asetatakse lava esiosa kohale pruun valgust varjav plaat, et ultraviolettkiired ei kahjustaks võrkkesta.
(6) Pinge ebastabiilsus vähendab kõrgsurve-elavhõbelambi kasutusiga ja valgusallika toiteallikas on varustatud pinge stabilisaatoriga.
(7) Elavhõbelambi eluea pikendamiseks saab selle välja lülitada 15 minutit pärast sisselülitamist; kui elavhõbedalambi luminofoorvõimsus on välja lülitatud, peab see ootama vähemalt 10 minutit, et elavhõbedaaur uuesti käivitada, et jahtuda ja naasda algsesse olekusse, vastasel juhul mõjutab see lambi eluiga.
Kujutise vaatlemine fluorestsentsmikroskoobiga:
(1) Umbes 5-10 minutit pärast fluorestsentsvalgusallika sisselülitamist kipub ergastava valguse intensiivsus olema stabiilne ja proov laaditakse vaatlemiseks; et vältida proovi fluorestsentsi summutamist, mis on põhjustatud liigsest ergastusvalgusest teravustamise ja objektide otsimise ajal, suumige esmalt fluorestsentsmikroskoopi välja, reguleerige ergastav valgus apertuurdiafragma abil mõõduka intensiivsusega või lisage ND-filter ja liigutage proovietappi regulaarselt. Pärast peegelpildi kinnitamist reguleerige pildistamiseks ja salvestamiseks fluorestsentsolekusse.
(2) Kehva pildikvaliteedi reguleerimine. Lisaks proovi ettevalmistamise teguritele on võimalik teha järgmised vajalikud kohandused:
① Välistage pildistamise optilisel teel valgust varjavad või valgust piiravad seadmed, nagu DIC-tarvikud, ND-filtrid jne.
②Reguleerige uuesti fluorestsentsmikroskoobi vastuvõtja fookust ja ava diafragma suurust.
③ Reguleerige hoolikalt fluorestsentsmikroskoobi objektiivi katvuse erinevuse korrigeerimisrõngast.
Fluorestsentsmikroskoopia rakenduspunktid
Fluorestsentsmikroskoopia kasutab "aktiinifluorestsentsi" kujutist. Kui valitud ergastuslainepikkus asub palja silmaga nähtamatus lähedal ultraviolettkiirguse piirkonnas (320-400nm), on ka fluorestsentsi emissioonispekter lühem kui tavaliste valguspeegelvalgusallikate keskmine lainepikkus. parandada. Suure energiaga footonid põrkuvad elektronidega, põhjustades elektronide ülemineku põhiolekust ergastatud olekusse. Ergastatud olekus elektronid on väga ebastabiilsed ja langevad tagasi põhiolekusse. Selles protsessis kulub osa soojusenergiast ja eralduvad uued footonid. Uuel footonil on madalam energia kui algsel footonil ja seetõttu on sellel pikem lainepikkus. Kuna uus footoni lainepikkus erineb langeva valguse footoni lainepikkusest, eraldatakse kaks erineva lainepikkusega valguskiirt teatud optilise töötlusmeetodi abil, nii et näeme ainult emiteeritud uusi footoneid (fluorestsentssignaal), st. fluorestsentsmikroskoop näeb fluorestsentspilte.
