Optilise mikroskoobi fluorestsentsvaatlus
Fluorestsents viitab protsessile, mille käigus fluorestseeruv aine kiirgab peaaegu samaaegselt pikema lainepikkusega valgust, kui seda kiiritatakse kindla lainepikkusega valgusega (joonis 1). Kui teatud lainepikkusega (ergastuslainepikkusega) valgus tabab molekuli, näiteks fluorofooris olevaid, neelduvad footoni energia molekuli elektronid. Järgmisena lähevad elektronid üle põhiolekust (S0) kõrgemale energiatasemele, ergastatud olekusse (S1'). Seda protsessi nimetatakse ergastamiseks①. Elektron viibib ergastatud olekus 10-9–10-8 sekundit, mille jooksul elektron kaotab osa energiast②. Ajal, mil elektronid väljuvad ergastatud olekust (S1) ja naasevad põhiolekusse③, vabaneb ergastusprotsessi käigus neeldunud ülejäänud energia.
Fluorestseeruv Jablonski diagramm
Fluorestseeruva molekuli viibimisaeg ergastatud olekus on fluorestsentsi eluiga, mis on üldiselt nanosekundi tasemel ja on fluorestsentsmolekuli enda omane omadus. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), mis kasutab fluorestsentsi eluaegse pildistamise tehnoloogiat, võib lisaks fluorestsentsi intensiivsuse pildistamisele teostada ka põhjalikumaid funktsionaalseid mõõtmisi ning saada molekulaarset konformatsiooni, molekulidevahelisi interaktsioone ja molekulide mikrokeskkonda jne. Teave, mida on raske leida. saada tavapärase optilise pildistamise abil.
Fluorestsentsi teine oluline omadus on Stokesi nihe ehk lainepikkuste erinevus ergastuse ja emissiooni piikide vahel (joonis 2). Tavaliselt on emissiooni lainepikkus pikem kui ergastuse lainepikkus. Selle põhjuseks on asjaolu, et elektronid kaotavad osa oma energiast lõõgastusprotsessi käigus pärast fluorestseeruva aine ergastamist ja enne footonite vabastamist. Suuremate Stokesi nihkega fluorestseeruvaid aineid on fluorestsentsmikroskoobi all lihtsam jälgida.
fluorestsentsmikroskoop
Fluorestsentsmikroskoop on optiline mikroskoop, mis kasutab vaatluseks ja pildistamiseks fluorestsentsomadusi ning mida kasutatakse laialdaselt erinevates valdkondades, nagu rakubioloogia, neurobioloogia, botaanika, mikrobioloogia, patoloogia ja geneetika. Fluorestsentskujutise eelisteks on kõrge tundlikkus ja kõrge spetsiifilisus ning see sobib väga hästi spetsiifiliste valkude ja organellide jaotumise jälgimiseks kudedes ja rakkudes, kolokalisatsiooni ja interaktsiooni uurimiseks, elu dünaamiliste protsesside (nt ioonide kontsentratsiooni muutuste) jälgimiseks. , jne.
Enamik rakkude molekule ei fluorestseeru ja kui soovite neid näha, märgistate need fluorestseeruvalt. Fluorestsentsmärgistamiseks on palju meetodeid, nagu otsene märgistamine (näiteks DAPI kasutamine DNA märgistamiseks) või immunovärvimine, kasutades antikehade antigeeni siduvaid omadusi, või fluorestseeruvate valkude (nt GFP, roheline fluorestseeruv valk) kasutamine sihtvalkude märgistamiseks. , ja pööratav köitmine. sünteetilised värvained (nt Fura-2) jne.
Pöördfluorestsentsmikroskoop MF53-N
Praeguseks on fluorestsentsmikroskoobist saanud erinevate laborite ja pildiplatvormide standardne pildistamisseade ning see on hea abimees meie igapäevastes katsetes. Fluorestsentsmikroskoobid jagunevad peamiselt kolme kategooriasse: püstised fluorestsentsmikroskoobid (sobivad lõikamiseks), pöördfluorestsentsmikroskoobid (sobivad elusrakkudele, võttes arvesse lõikumist), fluorestsents-stereoskoobid (sobivad suurematele isenditele, nagu taimed, sebrakala (täiskasvanud/embrüo). ), medaka, hiire/roti elundid jne).
Fluorestsentsmikroskoopia pildistamise tehnoloogia on laialdaselt kasutatav ja tüübirohke ning uued tehnoloogiad on alles tekkimas. Saate valida tehnoloogia oma uurimistöö lõpuleviimiseks.
