Fluorestsentsmikroskoopia erineb tavapärasest mikroskoopiast
Fluorestsentsmikroskoobid kasutavad ultraviolettvalgust valgusallikana, et kiiritada kontrollitavat objekti, nii et objekt kiirgab valgust, ja seejärel vaadelda objekti mikroskoobi all. Seda kasutatakse peamiselt immunofluorestsentsrakkude jaoks. See koosneb peamiselt valgusallikast, filtriplaadisüsteemist ja optilisest süsteemist, mis võimaldab vaadelda proovi fluorestseeruvat kujutist okulaari ja objektiiviläätse suurenduse kaudu. Vaatame, mis vahe on sellel fluorestsentsmikroskoobil ja tavalisel optilisel mikroskoobil.
1. Vaadake valgustusmeetodit
Fluorestsentsmikroskoobi valgustusmeetod on üldiselt episkoopiline, see tähendab, et valgusallikas projitseeritakse uuritavale proovile läbi objektiivi.
2. Vaadake eraldusvõimet
Fluorestsentsmikroskoobid kasutavad valgusallikana ultraviolettvalgust ja lainepikkus on suhteliselt lühike, kuid eraldusvõime on kõrgem kui tavalistel optilistel mikroskoopidel.
3. Filtri erinevus
Fluorestsentsmikroskoobid kasutavad kahte spetsiaalset filtrit, mida kasutatakse valgusallika ees nähtava valguse välja filtreerimiseks ning objektiivi ja okulaari vahel, et filtreerida välja ultraviolettkiired, mis võivad kaitsta inimese silmi.
Fluorestsentsmikroskoop on ka omamoodi optiline mikroskoop, peamiselt seetõttu, et fluorestsentsmikroskoobiga ergastav lainepikkus on lühike, mistõttu fluorestsentsmikroskoobi ja tavalise mikroskoobi struktuur ja kasutus on erinevad. Enamikul fluorestsentsmikroskoopidel on hea funktsioon nõrga valguse püüdmiseks, seega on selle pildistamisvõime ka ülinõrga fluorestsentsi korral hea. Koos fluorestsentsmikroskoopide pideva täiustamisega viimastel aastatel on müra ka oluliselt vähenenud. Seetõttu kasutatakse üha enam fluorestsentsmikroskoope.
paar
Teadmised fotonfluorestsentsmikroskoopia kohta
Kahe footoni ergastuse põhiprintsiip on: suure footonitiheduse korral suudavad fluorestseeruvad molekulid neelata korraga kahte pikalainelist footoni ning lühikese nn ergastatud oleku eluea järel kiirgavad lühema lainepikkusega footoni; efekt on sama, kui kasutataks fluorestseeruvate molekulide ergastamiseks footoni, mille lainepikkus on pool pika lainepikkusega. Kahe footoni ergastamiseks on vaja suurt footoni tihedust. Et rakke mitte kahjustada, kasutatakse kahe fotoni mikroskoopias suure energiaga režiimilukuga impulsslasereid. Selle laseri kiirgav laser on kõrge tippenergia ja madala keskmise energiaga, selle impulsi laius on vaid 100 femtosekundit ja selle sagedus võib ulatuda 80–100 megahertsini. Kui kasutatakse impulsslaseri footonite teravustamiseks suure numbrilise avaga objektiivi, on footonite tihedus objektiivi fookuspunktis suurim ja kahe footoni ergastus toimub ainult objektiivi fookuspunktis, nii et kahe fotoni mikroskoobi jaoks ei ole vaja konfokaalset ava, mis parandab fluorestsentsi tuvastamise efektiivsust.
Üldiste fluorestsentsnähtuste korral võib ergastusvalguse madala footonitiheduse tõttu fluorestseeruv molekul neelata korraga ainult ühte footoni ja seejärel kiirgada läbi kiirgussiirde fluorestseeruva footoni, mis on ühe footoni fluorestsents. Fluorestsentsi ergastusprotsessis, kus valgusallikana kasutatakse laserit, võib tekkida kahe- või isegi mitmefotoniline fluorestsents. Sel ajal on kasutatava ergastava valgusallika intensiivsus kõrge ja footonite tihedus vastab kahte footonit korraga neelavate fluorestseeruvate molekulide nõuetele. Üldlaseri kasutamisel ergastava valgusallikana ei piisa footoni tihedusest ikkagi kahe footoni neeldumise nähtuse tekitamiseks. Tavaliselt kasutatakse femtosekundilist impulsslaserit, mille hetkeline võimsus võib ulatuda megavatini. Seetõttu on kahe footoni fluorestsentsi lainepikkus lühem kui ergastusvalguse lainepikkus, mis on samaväärne ergastuse poolt tekitatava efektiga poole ergastuslainepikkuse juures.
Kahe fotoni fluorestsentsmikroskoopial on palju eeliseid:
1) pika lainepikkusega valgust mõjutab hajumine vähem kui lühikese lainepikkusega valgust ja see tungib kergesti proovi sisse;
2) väljaspool fookustasandit olevaid fluorestseeruvaid molekule ei ergutata, nii et rohkem ergastusvalgust jõuab fookustasandile, nii et ergastusvalgus võib tungida sügavamatesse proovidesse;
3) pika lainepikkusega lähiinfrapunavalgus on rakkudele vähem toksiline kui lühikese lainepikkusega valgus;
4) Proovide vaatlemiseks kahe footoni mikroskoobi kasutamisel ilmneb fotopleegitamine ja fototoksilisus ainult fookustasandil. Seetõttu on paksude proovide vaatlemiseks, elusrakkude vaatlemiseks või täppide fotopleegitamise katseteks sobivam kahefotonimikroskoopia kui ühefotoni mikroskoopia.
Teadmised konfokaalse fluorestsentsmikroskoopia kohta
Konfokaalse fluorestsentsmikroskoopia põhiprintsiip: proovi kiiritatakse punktvalgusallikaga ning fookustasandile moodustub väike, täpselt piiritletud valguslaik. Pärast punkti kiiritamist kogub kiirgav fluorestsents objektiivi läätsele ja saadetakse piki algset valgustusrada tagasi dikroonsest peeglist koosnevasse kiirjagurisse. Kiirjaotur saadab fluorestsentsi otse detektorisse. Valgusallika ja detektori ees on nõelaauk, mida nimetatakse vastavalt valgustusnõelaauguks ja tuvastusnõelaauguks. Nende kahe geomeetriline suurus on sama, umbes 100-200nm; fookustasandi valgustäpi suhtes on need kaks konjugeeritud, see tähendab, et valguspunkt läbib läätsede seeriat ja lõpuks saab seda korraga fokuseerida valgustusnõelaaugule ja tuvastusnõelaaugule. Sel viisil saab fookustasandi valgust tuvastusava ulatuses koonduda, samal ajal kui fookustasandist ülevalt või altpoolt tulev hajutatud valgus blokeeritakse väljaspool tuvastusava ja seda ei saa pildistada. Laser skaneerib proovi punkt-punktilt ning fotokordisti toru saab pärast nööpaugu tuvastamist ka punkt-punktilt vastava valguspunkti konfokaalse pildi, mis muundatakse digitaalseks signaaliks ja edastatakse arvutisse ning lõpuks koondatakse selgeks. kogu fookustasandi konfokaalne kujutis ekraanil.
Iga fokaaltasandi kujutis on tegelikult proovikeha optiline ristlõige ja sellel optilisel ristlõikel on alati teatud paksus, mida tuntakse ka optilise õhukese lõiguna. Kuna valguse intensiivsus fookuspunktis on palju suurem kui mittefookuspunktis ja mittefokaaltasandiline valgus filtreeritakse nööpnõela abil välja, on konfokaalse süsteemi teravussügavus ligikaudu null ja skaneerimine piki fookuspunkti. Z-telg võib teostada optilist tomograafiat, moodustades vaadeldava proovi fookuspunktis kahemõõtmelise optilise lõigu. Kombineerides XY tasapinna (fokaaltasandi) skaneerimise Z-telje (optilise telje) skaneerimisega, saab proovi kolmemõõtmelise kujutise saada pidevate kihtide kahemõõtmeliste kujutiste kogumisel ja töödelda spetsiaalse arvutitarkvaraga.
See tähendab, et tuvastusava ja valgusallika tihvtauk on alati fokuseeritud samasse punkti, nii et väljaspool fookustasandit ergastatud fluorestsents ei pääse tuvastamise auku.
Laserkonfokaalse tööpõhimõtte lihtne väljendus seisneb selles, et see kasutab valgusallikana laservalgust. Traditsioonilise fluorestsentsmikroskoobi kujutise põhjal lisab see laserskaneerimisseadme ja konjugeeritud teravustamisseadme ning see on süsteem digitaalsete kujutiste omandamiseks ja töötlemiseks arvuti juhtimise kaudu.
