Fluorestsentsmikroskoobi kasutamise meetodid ja ettevaatusabinõud
Kasutusmeetod:
(1) Asetage materjalileht kandurile.
(2) Lülitage fluorestsentsmikroskoobi pingeregulaator sisse. Seejärel vajutage süütamiseks stardirühma. UV-lampi ei tohi 15 minuti jooksul välja lülitada ega uuesti käivitada 3 minuti jooksul pärast selle väljalülitamist.
(3) Keerake ergastusfilter asendisse v, dikroonne kile asendisse v, valige 495 või 475 nm blokeeriv filter.
(4) Valige uvFL40, uvFL100 fluorestsentsi vastuvõtva objektiivi mikroskoopia.
(5) Lisage objektiklaasile mittefluorestseeruvat õli, esmalt 40x ja seejärel 100x teravustamismikroskoopia. Näita fluorestsentsi.
(7) Kuna fluorestseeruv materjal ultraviolettkiirguse mõjul koos fluorestsentsi kasvuga aja jooksul järk-järgult nõrgenes, tuleks mikroskoopilisel uurimisel sageli vaatevälja muuta.
(8) saab kasutada ka uvFL10 või uvFL20 väikese suurendusega mikroskoopiamaterjali (madala suurendusega, lisamata mittefluorestseeruvat õli).
Fluorestsentskujutise salvestamise meetod:
Fluorestsentsmikroskoobiga vaadeldav fluorestsentspilt, üks on morfoloogiliste tunnustega, teine on fluorestsentsi värvi ja heledusega, tulemuste hindamisel tuleb need kaks kombineerida tervikliku hinnanguga. Tulemused registreeritakse subjektiivsete näitajate alusel, st töötaja visuaalse vaatluse teel. Üldise kvalitatiivse vaatlusena põhimõtteliselt usaldusväärne. Tehnika ja teaduse arenedes kasutatakse erineval määral objektiivseid näitajaid kohtuotsuse tulemuste registreerimiseks, näiteks raku spektrofotomeetri, pildianalüsaatori ja muude instrumentide kasutamine. Nende instrumentidega registreeritud tulemusi tuleb aga kombineerida ka subjektiivse hinnanguga.
Fluorestsentsmikroskoobiga pildistamise tehnoloogia on fluorestsentspiltide salvestamiseks väga vajalik, sest fluorestsentsi on lihtne tuhmuda ja nõrgendada, et pildistamise tulemused koheselt jäädvustada. Meetod on põhimõtteliselt sama, mis tavaline mikrograafia. Peate lihtsalt kasutama kiiret fotofilmi, näiteks ASA200 ülal või 24. üle. Kuna ultraviolettvalgus fluorestsentsi plahvatuse efektile, nagu FITC-markerid, ultraviolettkiirguse kiiritamisel 30s, vähenes fluorestsentsi heledus 50%. Seetõttu on särituskiirus fluorestsentspildi jäädvustamiseks liiga aeglane. Ülduuringute fluorestsentsmikroskoobidel on poolautomaatsed või täisautomaatsed mikrofotograafia süsteemiseadmed.
Ettevaatusabinõud:
(1) Töötage rangelt vastavalt fluorestsentsmikroskoobi tehase käsiraamatu nõuetele, ärge muutke protseduuri meelevaldselt.
(2) Ülevaatus tuleks läbi viia pimedas. Pärast pimedasse ruumi sisenemist ühendage toiteallikas, süütage ülikõrgsurve elavhõbedalamp 5-15min, oodake, kuni valgusallika stabiliseerimiseks kiirgab tugevat valgust ja silmad on pimeda ruumiga täielikult kohanenud ja seejärel alustage isendi vaatlemist.
(3) Vältimaks ultraviolettkiirguse põhjustatud silmade kahjustamist, tuleks valgusallika reguleerimisel kanda kaitseprille.
(4) Kontrollige aega iga kord, et 1 ~ 2h on asjakohane, rohkem kui 90 min, ülikõrgsurve elavhõbeda lambi valgustugevus vähenes järk-järgult, fluorestsents nõrgeneb; proove kiiritatakse ultraviolettvalgusega 3 ~ 5 min, fluorestsents on samuti oluliselt nõrgenenud; seetõttu ei tohi * olla pikem kui 2–3 tundi.
(5) Fluorestsentsmikroskoobi valgusallika eluiga on piiratud, proovi tuleks aja säästmiseks ja valgusallika kaitsmiseks tsentraliseeritud kontrolli all hoida. Kui see on kuum, tuleks lisada ventilaatorjahutus, uus pirn tuleb salvestada kasutamise algusest. Kui lamp on kustunud ja seda soovitakse uuesti kasutada, tuleb pirn enne süttimist piisavalt maha jahutada. Valgusallikat tuleks mitu korda vältida.
(6) Vaadake proovi kohe pärast värvimist, kuna fluorestsents väheneb aja jooksul järk-järgult. Kui proov asetatakse polüetüleenist kilekotti, mida hoitakse 4 kraadi juures, võib see fluorestsentsi nõrgenemise aega edasi lükata ja takistada tihendusaine aurustumist.
(7) Fluorestsentsi heleduse hindamiskriteeriumid: tavaliselt jagatud neljaks tasemeks, st „üks” – fluorestsents puudub või on nähtav nõrk. '+' – ainult selgelt nähtav fluorestsents. '+ +' – nähtav heledusega
