Fluorestsentsmikroskoobi põhimõtte rakendamine ja kasutamine
(1) Fluorestsentsmikroskoobi põhimõte ja struktuuriomadused: fluorestsentsmikroskoobis kasutatakse suure valgustõhususega punktvalgusallikat, et kiirata läbi filtrisüsteemi teatud lainepikkusega valgust (nt ultraviolettvalgus 3650 tolli või lilla sinine valgus 4200 tolli). ergastusvalgusena proovi ergastamiseks. Pärast seda, kui sees olev fluorestseeruv aine kiirgab erinevat värvi fluorestsentsi, jälgitakse seda objektiiviläätse ja okulaari suurenduse kaudu. Sel viisil on tugeva kontrastfooni korral isegi väga nõrga fluorestsentsiga seda lihtne tuvastada ja see on kõrge tundlikkusega. Seda kasutatakse peamiselt rakkude struktuuri ja funktsioonide ning keemilise koostise uurimiseks. Fluorestsentsmikroskoobi põhistruktuur koosneb tavalisest optilisest mikroskoobist ja mõnedest tarvikutest (nagu fluorestsentsvalgusallikas, ergastusfilter, kahevärviline kiire jaotur ja blokeeriv filter jne). Luminofoorvalgusallikas – üldiselt kasutatakse ülikõrgsurve elavhõbedalampi (50-200W), mis võib kiirata erineva lainepikkusega valgust, kuid igal fluorestseeruval ainel on ergastuslainepikkus, mis tekitab kõige tugevama fluorestsentsi, seega ergastusfilter ( Üldiselt on olemas ultraviolett-, lilla-, sinine ja roheline ergastusfiltrid), mis lasevad läbi ainult teatud lainepikkusega ergastusvalgust ja kiiritavad proovi, neelates samal ajal muud valgust. Pärast iga aine kiiritamist ergastusvalgusega kiirgab see väga lühikese aja jooksul nähtavat fluorestsentsi, mille lainepikkus on pikem kui kiirguse lainepikkus. Fluorestsents on spetsiifiline ja üldiselt nõrgem kui ergastusvalgus. Spetsiifilise fluorestsentsi jälgimiseks on objektiivi taga vaja blokeerivat (või summutavat) filtrit. Sellel on kaks funktsiooni: üks on ergastava valguse neelamine ja okulaari sisenemise blokeerimine, et mitte häirida fluorestsentsi ega kahjustada silmi; teine on valida ja lasta läbida spetsiifiline fluorestsents, mis näitab konkreetset fluorestseeruvat värvi. Neid kahte filtrit tuleb kasutada koos.
Fluorestsentsmikroskoope on nende optiliste radade osas kahte tüüpi:
1. Läbilaskev fluorestsentsmikroskoop: ergastusvalgusallikas lastakse fluorestsentsi ergutamiseks läbi proovimaterjali läbi kondensaatorläätse. Tavaliselt kasutatakse tumevälja kollektorit ja tavalist kollektorit saab kasutada ka peegli reguleerimiseks nii, et ergastusvalgus suunatakse ümber ja suunatakse proovile mööda. See on vanem fluorestsentsmikroskoop. Eeliseks on see, et fluorestsents on madalal suurendusel tugev, kuid puuduseks on see, et fluorestsents väheneb suurenduse suurenedes. Seetõttu on parem vaadelda suuremaid proovimaterjale.
2. Epi-fluorestsentsmikroskoop on uut tüüpi fluorestsentsmikroskoop, mis on välja töötatud kaasajal. Erinevus seisneb selles, et ergastusvalgus langeb objektiiviläätselt katsekeha pinnale, see tähendab, et valgustuskondensaatorina ja fluorestsentsi kogumise objektiivina kasutatakse sama objektiivi. Valgusteele, mis on heledast uraanist 45 kraadi kaugusel, tuleb lisada dikroonne kiirjagur. Ergastusvalgus peegeldub objektiivil ja kogutakse proovile. Proovi tekitatud fluorestsents ja objektiivi läätse pinnalt ja katteklaasi pinnalt peegelduv ergastusvalgus sisenevad objektiivi üheaegselt ja naasevad kahevärvilise kiire jaoturisse, et muuta ergastusvalgus. Eraldatud fluorestsentsist , jääkergutusvalgus neeldub blokeerivate filtrite poolt. Näiteks erinevate ergastusfiltrite / kahevärviliste kiirte jaoturi / blokeerimisfiltri kombinatsiooni vahetamine võib vastata erinevate fluorestseeruvate reaktsiooniproduktide vajadustele. Seda tüüpi fluorestsentsmikroskoobi eeliseks on see, et vaatevälja valgustus on ühtlane, kujutis on selge ja mida suurem on suurendus, seda tugevam on fluorestsents.
(2) Kuidas kasutada fluorestsentsmikroskoopi.
1. Lülitage valgusallikas sisse ja ülikõrgsurve elavhõbedalamp peab heledaima punkti saavutamiseks mõne minuti soojenema.
2. Läbilaskev fluorestsentsmikroskoop peab paigaldama vajaliku ergastusfiltri valgusallika ja kondensaatori vahele ning paigaldama vastava blokeerimisfiltri objektiivi taha. Epi-fluorestsentsmikroskoobid peavad sisestama valgusteel olevatesse piludesse vajalikud ergastusfiltrid/kahevärvilised kiirjaoturid/blokeerivad filtrid.
3. Vaadake väikese suurendusega objektiiviga ja reguleerige valgusallika keskosa nii, et see asuks kogu valgustuspunkti keskel vastavalt erinevate fluorestsentsmikroskoobi mudelite reguleerimisseadmele.
4. Asetage proovitükk ja jälgige pärast teravustamist. Kasutamisel tuleb olla tähelepanelik: ärge jälgige otse otsafiltriga, et mitte kahjustada silmi; proovide vaatlemisel õliläätsega tuleb kasutada spetsiaalset fluorestsentsita õliläätse; pärast kõrgsurve elavhõbedalambi väljalülitamist ei saa seda kohe uuesti sisse lülitada, seda on vaja testida. Selle saab taaskäivitada 5 minuti pärast, vastasel juhul on see ebastabiilne ja mõjutab elavhõbedalambi eluiga.
(3) Jälgige rakke, mis on värvitud 0,01-protsendilise akridiinoranži fluorestsentsvärviga, fluorestsentsmikroskoobi all õppeplatvormil sinise-violetse valguse filtriga. Tuum ja tsütoplasma on ergastatud, et tekitada kaks erinevat värvi fluorestsentsi (tumeroheline ja oranžikaspunane).
