Fluorestsentsmikroskoobi ja tavalise optilise mikroskoobi erinevused ja omadused
Fluorestsentsmikroskoop ja tavaline optiline mikroskoop on erinevad, proovi vaadeldakse mitte tavalise valgusallika valgustamisega, vaid teatud valguse lainepikkuse (tavaliselt ultraviolett, sini-violetne valgus) ergastamine proovis oleva fluorestsentsmaterjaliga. mikroskoobi all, nii et fluorestsentsmikroskoobi valgusallika fluorestsents ei valgusta otsest valgustust, vaid ergastab fluorestseeruvat materjali energiaallika proovis. Põhjus, miks me saame katsekeha vaadelda, ei tulene valgusallika valgustusest, vaid fluorestsentsnähtusest, mis ilmneb proovis oleva fluorestseeruva materjali poolt pärast ergastuse valgusenergia neelamist. On näha, et fluorestsentsmikroskoobi omadused, peamiselt selle valgusallikas, suudavad pakkuda suurt hulka ergastusvalguse spetsiifilist lainepikkuse vahemikku, nii et uuritavas proovis olev fluorestseeruv materjal suudab saada vajaliku ergastusvalguse intensiivsuse. Samas peab fluorestsentsmikroskoobis olema vastav filtrisüsteem. Fluorestsentsmikroskoop on fluorestsentshistokeemia põhitööriist. See koosneb ülikõrgsurve valgusallikast, filtrisüsteemist (sealhulgas ergastus- ja summutusfiltriplaadist), optilisest süsteemist ja fotosüsteemist ning muudest peamistest komponentidest, on teatud valguse lainepikkuse kasutamine, et stimuleerida proovi fluorestsentsi kiirgama.
1. fluorestsentsi ergastamise viis: vastavalt lainepikkuse vahemikule jaguneb valgus UV-ergastusmeetodiks (kasutades ultraviolettvalgust) ja BV-ergastusmeetodiks (kasutades sinist violetset valgust) kahte tüüpi UV-ergastusmeetodit on ultraviolettvalguse lähedal lühem kui 400 nm. erutus. Selle meetodi puhul ei ole nähtavat ergastusvalgust, seega näitab vaadeldav fluorestsents värvainele omast fluorestsentsi ja proovi spetsiifilist fluorestsentsi on lihtne taustkoe isefluorestsentsist eristada.
2. BV ergastusmeetod: meetodi keskmes on 404 nm, 434 nm ultraviolettkiirgusest ergastamiseks sinisele valgusele. See meetod kasutab proovi kiiritamiseks sinist valgust, seega peab fluorestsentsvaatlussüsteemi väljalülitusfilter kasutama filtrit, mis suudab täielikult blokeerida sinise valguse ja suudab piisavalt läbida soovitud rohelise ja kollase fluorestsentsi. Fluorestseeruvad pigmendid fluorestseeruvate antikehade meetodi jaoks. Kuna ergastava valguse maksimaalse neeldumise lainepikkus ja fluorestsentsi maksimaalse emissiooni lainepikkus on teineteisele lähedased, peavad BV ergastusmeetodil kasutatavad filtrid olema teravad lõikefiltrid. See meetod kasutab ergastusvalgusena sinist valgust, nii et fluorokroomi neeldumistõhusus on kõrgem ja saab heledama pildi. Puuduseks on see, et alla 500 nm fluorestsentsi pole näha ja üle 500 nm paistab kogu pilt kollane. Fluorestseeruva antikeha meetodi puhul hinnatakse suuremat osa spetsiifilisusest fluorokroomi ainulaadse värvuse järgi, nii et ülalkirjeldatud BV ergastusmeetodi puudused kipuvad peene spetsiifilisuse arutamisel olema äärmiselt mõjukad.
