Mikroobide otseloendamine mikroskoobiga
Eksperimentaalne põhimõte
Mikroskoobi all olev otseloendamine hemotsütomeetriga on tavaliselt kasutatav mikroobide loendamise meetod. Selle meetodi eeliseks on see, et see on intuitiivne ja kiire. Asetage sobivalt lahjendatud bakterisuspensioon (või spoorisuspensioon) slaidi ja hemotsütomeetri katteklaasi vahele jäävasse loenduskambrisse ning loendage mikroskoobi all. Kuna loenduskambri maht on fikseeritud (0,1 mm2), saab selle teisendada mikroorganismide koguarvuks ruumalaühiku kohta vastavalt mikroskoobi all täheldatud mikroorganismide arvule. Kuna see meetod loendab elusate ja surnud bakterite summat, nimetatakse seda ka kogubakterite loendamise meetodiks.
Hemotsütomeeter on tavaliselt spetsiaalne klaasklaas, millel neli soont moodustavad kolm platvormi. Keskel asuv platvorm on lühikese horisontaalse soonega jagatud kaheks pooleks. Platvormile on mõlemale küljele graveeritud ruudustik. Iga ruudustik on jagatud üheksaks suureks ruuduks. Keskel asuv suur ruut on loendusruum. Mikroorganisme loendatakse loenduskambris. Vererakkude loendusplaadi struktuur on näidatud joonisel Ⅷ-1.
Loendusruumi skaalal on üldiselt kaks spetsifikatsiooni, üks on see, et suur ruut on jagatud 16 keskmiseks ruuduks ja iga keskmine ruut on jagatud 25 väikeseks ruuduks (joonis Ⅷ-2); teine on suur ruut. Ruut on jagatud 25 keskmiseks ruuduks ja iga keskmine ruut on jagatud 16 väikeseks ruuduks (joonis Ⅷ-1, C). Kuid olenemata sellest, milline loenduslaud on, on iga suure ruudu väikeste ruutude arv sama, st 16×25=400 väikest ruutu, nagu on näidatud joonisel Ⅷ-2.
Iga suure ruudu külje pikkus on 1 mm ja iga suure ruudu pindala on 1 mm2. Pärast katteklaasi katmist on slaidiklaasi ja katteklaasi vaheline kõrgus 0,1 mm, seega on loenduskambri maht 0,1 mm3.
Loendamisel loendage tavaliselt viies keskmises ruudustikus olevate bakterite koguarv, seejärel saate iga keskmise ruudustiku keskmise väärtuse ja korrutage seejärel 16 või 25-ga, et saada bakterite koguarv suures ruudustikus, ja seejärel teisendatakse bakterite koguarv 1 ml bakterilahuses.
Laboratoorsed seadmed
Hemotsütomeeter, mikroskoop, katteklaas, steriilne kapillaar;
Eksperimentaalsed materjalid
Saccharomyces cerevisiae suspensioon
Eksperimentaalne protseduur (mikroobse mikroskoobi otseloendamise meetod)
1. lahjendamine
Saccharomyces cerevisiae suspensioon tuleb korralikult lahjendada. Kui bakterilahus ei ole paks, ei pea seda lahjendama.
2. Mikroskoopiline loendusruum
Enne proovide lisamist kontrollige mikroskoopiliselt loendusplaadi loenduskambrit. Kui on mustust, tuleb see enne loendamist puhastada.
3. lisa proov
Katke puhas ja kuiv hemotsütomeetri plaat katteklaasiga ning seejärel tilgutage steriilse peene suuga tilguti abil katteklaasi servast väike tilk lahjendatud Saccharomyces cerevisiae lahust (mitte liiga palju), nii et bakterilahus on lõhe lähedal piki vahet. Kapillaarosmoos siseneb loenduskambrisse iseenesest ja üldise loenduskambri saab täita bakteriaalse vedelikuga. Olge ettevaatlik, et õhumulle ei tekiks.
4. mikroskoobi loendus
Pärast 5-minutilist puhkamist asetage hemotsütomeeter mikroskoobi lavale, kasutage esmalt väikese võimsusega läätse loenduskambri asukoha leidmiseks ja seejärel lülitage loendamiseks suure võimsusega läätsele. Kui enne loendamist leitakse, et bakterilahus on liiga paks või liiga õhuke, tuleb enne loendamist lahjendus uuesti reguleerida. Üldiselt vajab proovi lahjendamine igas rakus umbes 5-10 bakterit. Iga loenduskamber valib loendamiseks bakterid 5 keskmises ruudustikus (valikuline 4 nurka ja keskvõre). Võrgujoonel olevaid baktereid loetakse üldiselt ainult ülemisel ja paremal real. Pärmseene tärkamise korral, kui pungakeha suurus ulatub poole emarakust, loe kaks bakterit. Loendage proov, et arvutada kahes loenduskambris loendatud väärtuste põhjal proovi bakterite sisaldus.
5. Hemotsütomeetri puhastamine
Pärast kasutamist loputage kraanil olevat vererakkude loendusplaati veejugadega, ärge peske seda kõvade esemetega ning kuivatage pärast pesu ise või fööniga. Mikroskoopiline uurimine, jälgige, kas igas rakus on jääkbaktereid või muid setteid. Kui see pole puhas, tuleb seda korduvalt pesta, kuni see on puhas.
