Mikroorganismide arvukuse määramine- Mikroskoopiline otseloenduse meetod!
Bakterite populatsiooni kasv väljendub rakkude arvu suurenemises või rakulise materjali suurenemises. Rakkude arvu määramise meetodid hõlmavad otsest mikroskoopilist loendust, plaatide arvu, hägususe hindamist spektrofotomeetriga, kõige tõenäolisemat MPN-i arvu ja membraanfiltreerimist. (membraanfiltratsioon) jne. Rakuliste ainete mõõtmise meetodid hõlmavad rakkude kuivmassi määramist, teatud rakukomponentide, nagu lämmastikusisalduse, RNA ja DNA sisalduse määramist ning metaboliitproduktide määramist. Lühidalt öeldes on mikroobide kasvu mõõtmiseks palju meetodeid, millest igaühel on oma eelised ja puudused. Meetod tuleks valida vastavalt töö spetsiifilistele nõuetele. See katse tutvustab peamiselt tootmis- ja teadustöös sageli kasutatavat mikroskoobi otseloendamise meetodit.
1. Eesmärgi nõuded
1. Selgitage vererakkude loenduslauaga loendamise põhimõtet.
2. Omandage mikroorganismide loendamise meetod vererakkude loenduslaua abil.
2. Põhiprintsiibid
Mikroskoobi otseloendamise meetod on lihtne, kiire ja intuitiivne meetod, mis asetab väikese koguse uuritava proovi suspensiooni kindlale pindala ja mahuga spetsiaalsele objektiklaasile (nimetatakse ka bakteriomeetriks) ning loendab selle otse mikroskoobi all. meetodid. Praegu on kodu- ja välismaal tavaliselt kasutatavad bakteriomeetrid: hemotsütomeeter, Peteroff-Hauseri bakteriomeeter ja Hawksley bakteriomeeter jne. Neid kõiki saab kasutada pärmi, bakterite, hallitusseente eoste ja muude suspensioonide loendamiseks ning põhiprintsiibid on samad. Viimase kahe bakteriloenduri kogumaht on pärast katteklaasiga katmist 0.02 mm3 ning katteklaasi ja slaidi vaheline kaugus on vaid 0,02 mm. Seetõttu saab õlikümblusobjektiivi objektiivi kasutada väiksemate rakkude, näiteks bakterite, vaatlemiseks ja tuvastamiseks. loendama. Lisaks nende bakteriomeetrite kasutamisele on olemas ka hindamismeetod, mis jälgib vahetult mikroskoobi all määrdumisala ja nägemisvälja pindala suhet. Seda meetodit kasutatakse tavaliselt piima bakterioloogiliseks uurimiseks. Mikroskoobi otseloendamise meetodi eelisteks on selle intuitiivne, kiire ja lihtne käsitsemine. Selle meetodi puuduseks on aga see, et mõõdetud tulemus on tavaliselt surnud bakterite ja elusbakterite summa. Praegu on selle puuduse ületamiseks mõned meetodid, näiteks elujõuliste bakterite kombineerimine, mis värvivad mikrokambrikultuuri (lühiajaline) ja rakkude jagunemise inhibiitorite lisamine, et saavutada ainult elujõuliste bakterite loendamise eesmärk.
Selles katses kasutatakse mikroskoobi all otsese loendamise näitena hemotsütomeetrit. Ülejäänud kahe bakteriomeetri kasutamise kohta lugege palun iga tootja juhiseid. Otsene loendamine mikroskoobi all hemotsütomeetriga on tavaliselt kasutatav mikroobide loendusmeetod. Loenduslaud on spetsiaalne liug, millel on neli soont, mis moodustavad kolm platvormi; keskel asuv laiem platvorm on lühikese horisontaalse soonega jagatud kaheks pooleks ning platvormi mõlemal küljel on võrevõre. Iga ruutvõrk on jagatud üheksaks suureks ruuduks ja keskel asuv suur ruut on loendusruum. Vererakkude loendusplaadi struktuur on näidatud joonisel {{0}}. Loenduskambri skaala jaoks on üldiselt kaks spetsifikatsiooni. Üks on suur ruut, mis on jagatud 25 keskmiseks ruuduks ja iga keskmine ruut on jagatud 16 väikeseks ruuduks (joonis 15-2); teine on suur ruut. Ruutruudustik on jagatud 16 keskmiseks ruuduks ja iga keskmine ruut on jagatud 25 väikeseks ruuduks. Kuid olenemata sellest, milline loenduslaud on, on igas suures ruudus 400 väikest ruutu. Iga suure ruudu küljepikkus on lmm, siis iga suure ruudu pindala on lmm2. Pärast katteklaasi katmist on katteklaasi ja slaidi vaheline kõrgus 0,lmm, seega on loenduskambri maht 0,lmm3 (üks kümnetuhandik milliliitrit). Joonis 15-1 Vererakkude loendusplaadi struktuur (1) Joonis 15-2 Vererakkude loendusplaadi struktuur (2) A. Eestvaade; B. Pikisuunaline läbilõige; suurendatud ruutruudustik, suur ruut keskel on loenduskamber 1. Vererakkude loenduslaud; 2. Katteklaas; 3. Loendamiskambris loendades loendage tavaliselt bakterite koguarv viies ruudus, seejärel leidke iga ruudu keskmine väärtus ja korrutage seejärel 25 või 16-ga, et saada Bakterite koguarv suures ruudus teisendatakse bakterite koguarvuks 1 ml bakterilahuses. Oletame, et viie keskmise ruudu bakterite koguarv on A ja bakterilahuse lahjendustegur on B. Kui tegemist on 25 keskmise ruuduga loendusplaadiga, siis bakterite koguarv 1 ml bakterilahuses {{ 23}} A/5×25×104× B=50000A·B (tükki) Samamoodi, kui tegemist on 16 ruuduga loendusplaadiga, siis bakterite koguarv 1 ml bakterilahuses {{ 30}}A/5×16×104×B=32000A·B (tükki),
