Konfokaalse mikroskoobi ja tavalise optilise mikroskoobi võrdlus
Üldine optiline mikroskoop
Üldine bioloogiline mikroskoop koosneb kolmest osast, nimelt: ① valgustussüsteem, sealhulgas valgusallikas ja kondensaator; ② Optiline võimendussüsteem, mis koosneb objektiivist ja okulaarist, on mikroskoobi põhiosa. Sfäärilise aberratsiooni ja kromaatilise aberratsiooni kõrvaldamiseks koosnevad nii okulaar kui ka objektiivi läätsed keerukatest läätserühmadest; (3) mehaaniline seade, mida kasutatakse materjalide kinnitamiseks ja mugavaks jälgimiseks.
See, kas mikroskoobi pilt on selge või mitte, ei sõltu ainult suurendusest, vaid ka mikroskoobi eraldusvõimest. Eraldusvõime viitab mikroskoobi (või koha, kus inimese silmad on sihtmärgist 25 cm kaugusel) võimele eristada objekti zui väikest intervalli. Eraldusvõime sõltub valguse lainepikkusest, avasuhtest ja kandja murdumisnäitajast, mida väljendatakse järgmise valemiga:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsin /2
Kus: n= keskkonna murdumisnäitaja;=peeglinurk (proovi avanemisnurk objektiivi ava suhtes) ja NA= numbriline ava. Peegli nurk on alati väiksem kui 180? Seetõttu peab sina/2 zui väärtus olema väiksem kui 1.
Optiliste läätsede valmistamiseks kasutatava klaasi murdumisnäitaja on 1,65–1,78 ja kasutatava kandja murdumisnäitaja on klaasi omale lähemal, seda parem. Kuiva objektiivi puhul on keskkond õhk ja ava suhe on üldiselt 0.05 ~ 0,95; Õlilääts kasutab keskkonnana lõhnavat asfalti ja objektiivi avanemiskiirus võib olla 1,5 lähedal.
Tavalise valguse lainepikkus on 400~700 nm, seega ei ole mikroskoobi eraldusvõime väiksem kui 0,2 μm ja inimsilma eraldusvõime on 0,2 mm, seega on zui suur suurendus, mille on kujundanud Üldmikroskoop on tavaliselt 1000X x.
Miks on vaja konfokaalset mikroskoopi?
1. Optiline mikroskoop on täiustatud meie suurte eelkäijate jõupingutuste ja täiustamise kaudu. Tegelikult saavad tavalised mikroskoobid meile lihtsalt ja kiiresti ilusaid mikroskoopilisi pilte anda. Siiski juhtus sündmus, mis tõi sellesse peaaegu täiuslikku mikroskoobimaailma revolutsioonilise uuenduse, milleks on "laserskaneeriva konfokaalse mikroskoobi" leiutis. Seda uut mikroskoopi iseloomustab optilise süsteemi kasutuselevõtt, mis eraldab pilditeabe ainult sellel tasapinnal, kuhu fookus on kontsentreeritud, ja taastab saadud teabe pildimällu, muutes fookust, et saada erkpilt täieliku kolmemõõtmelise teabega. saab kätte. Selle meetodi abil saab lihtsalt saada teavet pinna kuju kohta, mida tavamikroskoopidega ei saa kinnitada. Lisaks on tavaliste optiliste mikroskoopide puhul "eraldusvõime parandamine" ja "teravustamise sügavuse süvendamine" vastuolulised tingimused, eriti suure suurenduse korral, kuid konfokaalsete mikroskoopide puhul on see probleem lahendatud.
2. Konfokaalse optilise süsteemi eelised
Konfokaalne optiline süsteem valgustab proovipunkti ja peegeldunud valgust võtavad vastu ka punktretseptorid. Kui proov asetatakse fookusasendisse, võib peaaegu kogu peegeldunud valgus jõuda fotoretseptorini, kuid kui proov kaldub fookusest kõrvale, ei jõua peegeldunud valgus fotoretseptorisse. See tähendab, et konfokaalses optilises süsteemis väljastatakse ainult fookusega kattuv pilt ning facula ja kasutu hajutatud valgus on varjestatud.
3. Miks kasutada laserit?
Konfokaalses optilises süsteemis on näidis valgustatud ja peegeldunud valgust võtab vastu ka punktfotoretseptor. Seetõttu muutub vajalikuks punktvalgusallikas. Laser kuulub väga punktvalgusallikasse. Enamikul juhtudel kasutab konfokaalse mikroskoobi valgusallikas laservalgusallikat. Lisaks on laseri laialdase kasutamise olulised põhjused ka laseri omadused, nagu monokromaatilisus, suunavus ja suurepärane kiire kuju.
4. Võimalik on kiirel skaneerimisel põhinev reaalajas vaatlemine.
Laserskaneerimisel kasutatakse akustilist optilist deflektorit (AO prime element) horisontaalsuunas ja Servo Galvano peeglit vertikaalsuunas. Kuna akustilises optilises läbipaindeseadmes ei ole mehaanilist vibratsiooniosa, saab see skaneerida suurel kiirusel ja seda on võimalik jälgida reaalajas jälgimisekraanil. Selle kaamera suur kiirus on väga oluline projekt, mis mõjutab otseselt teravustamise ja asukoha otsimise kiirust.
5. Fookuse asendi ja heleduse vaheline seos
Konfokaalses optilises süsteemis, kui proov on õigesti fookusasendis asetatud, on heledus suur ning enne ja pärast seda langeb selle heledus järsult (joonisel 4 pidev joon). See fookustasandi tundlik selektiivsus on ka konfokaalse mikroskoobi kõrguse suuna mõõtmise ja fookussügavuse laiendamise põhimõte. Seevastu tavalisel optilisel mikroskoobil pole selget heleduse muutust enne ja pärast fookusasendit (punktiirjoon joonisel 4).
6. Kõrge kontrastsus ja kõrge eraldusvõime
Üldises optilises mikroskoobis häirib fookusest kõrvalekalduv valgus ja see kattub fookuse kujutise osaga, vähendades seega pildi kontrastsust. Seevastu konfokaalses optilises süsteemis eemaldatakse fookusest väljapoole hajutatud valgus ja objektiivi sees hajuv valgus peaaegu täielikult, nii et saab väga suure kontrastsusega pildi. Lisaks, kuna valgus läbib objektiivi kaks korda, teravatakse esmalt punktpilti ning paraneb ka mikroskoobi eraldusvõime.
7. Optilise lokaliseerimise funktsioon
Konfokaalses optilises süsteemis on muu osa kui fookuspunkti peegeldunud valgus varjestatud mikropooridega. Seetõttu moodustub kolmemõõtmelise proovi vaatlemisel selline pilt, mis tekkis pärast proovi fookusega viilutamist (joonis 5). Seda efekti nimetatakse optiliseks lokaliseerimiseks, mis kuulub ühte konfokaalse optilise süsteemi erialadest.
8. Fookuse liikuva mälu funktsioon
Nn peegeldunud valgust väljaspool fookust varjavad mikropoorid. Teisest küljest võib arvestada, et kõik punktid kujutisel, mille moodustab konfokaalne optiline süsteem, langevad fookusega kokku. Seega, kui kolmemõõtmelist näidist liigutada Z-telje (optilise telje) suunas, siis pilt koguneb ja salvestatakse mällu ning zui saab lõpuks kogu näidise ja fookuse kokkulangemisel moodustunud pildi. . Sel viisil nimetatakse lõpmatu teravustamise sügavuse funktsiooni mobiilse mälu funktsiooniks.
9. Pinna kuju mõõtmise funktsioon
Fookuse liigutamise funktsioonis saab proovi pinna kuju mõõta kontaktivabalt, lisades kõrguse salvestussilmuse. Selle funktsiooni alusel on võimalik igas pikslis salvestada zui suure heleduse väärtusega moodustatud Z-telje koordinaate ning selle info põhjal saab proovi pinnakujuga seotud informatsiooni.
10. ülitäpne mikromõõdu mõõtmise funktsioon
Valguse vastuvõtuseade võtab kasutusele ühemõõtmelise CCD-pildianduri, nii et skaneerimisseadme skaneerimise kalle ei saa seda mõjutada, nii et ülitäpse mõõtmise saab lõpule viia. Lisaks, kuna samaaegselt võetakse vastu reguleeritava fookussügavusega fookuse liikumise mälufunktsioon, saab fookuse nihkest põhjustatud mõõtmisvea kõrvaldada.
11. Kolmemõõtmeline kujutise analüüs
Pinnakuju mõõtmise funktsiooni abil saab proovipinnast hõlpsasti teha kolmemõõtmelise kujutise. Lisaks sellele saab läbi viia ka mitmesuguseid analüüse, näiteks: pinna kareduse mõõtmine, pindala, maht, pindala, ringikujulisus, raadius, zui pikkus, perimeeter, raskuskese, tomograafiline kujutis, FFT teisendus, joon laiuse mõõtmine ja nii edasi.
Laserkonfokaalset skaneerivat mikroskoopi saab kasutada mitte ainult raku morfoloogia jälgimiseks, vaid ka rakkude biokeemiliste komponentide kvantitatiivseks analüüsiks, optilise tiheduse statistikaks ja raku morfoloogia mõõtmiseks.
