Kaasaegse mikroskoobi kontseptsiooni rakendamine mikroskoopilise maailma vaatlemisel
Iidsetest aegadest tänapäevani on inimesed taotlenud kõrgemaid ja kaugemaid tõdesid. Alates ookeanireisidest kuni kosmoseuuringuteni on inimesed üksteise järel saavutanud suuri eesmärke. Makroskoopiline maailm, mida inimesed palja silmaga näevad, ei ole aga terve maailm ja inimsilm ei näe seda selgelt. Samuti meelitab see lugematuid inimesi avastama ja jälitama.
Olenemata makroskoopilistest või mikroskoopilistest asjadest põhinevad meie vaatlused kolmemõõtmelise ruumi, see tähendab XYZ kolmemõõtmelise ruumi atribuutidel ja asjade kuju muutuste jälgimisel tuleb kasutusele võtta veel üks mõõtefaktor - aeg T, seega kõige täiuslikum viis asjade vaatlemiseks peab olema XYZT samaaegne salvestamine, st kuju ja aja pikaajaline pildistamine, on ka mikroskoobi ülim funktsioon.
Pärast enam kui 300 aastat kestnud arengut on kaasaegsed mikroskoobid välja pakkunud selliseid kontseptsioone nagu eraldusvõime, teravussügavus ja vaateväli ning pakkunud pidevalt välja lahendusi. Mikroskoobid on esialgu täitnud meie vajadused mikroskoopilise maailma vaatlemisel ning aidanud meil salvestada mikroskoopilise maailma ruumi ja aega.
Mikroskoopilises maailmavaatluses on kõige olulisem detailide lahutusvõime ja sellest sündiski resolutsiooni mõiste. Eraldusvõime viitab minimaalsele kaugusele kahe punkti vahel, mida inimsilm suudab eristada, ja see kehtib ainult XY dimensioonis. Rayleighi kriteeriumi, Rayleighi kriteeriumi järgi on piir, mida tavalised inimesed eristavad, kaks 0,2 mm suurust punkti 25 cm kaugusel. Kui kasutame mikroskoopi, näeme kahte punkti väiksema vahemaa tagant, mis parandab meie vaatluse eraldusvõimet. Kaasaegse teadustöö pideva süvenemisega kasvavad pidevalt ka inimeste nõuded eraldusvõimele, samuti täiustavad teadlased pidevalt mikroskoopide lahutusvõimet. Näiteks elektronmikroskoobid on suurendanud eraldusvõimet nanomeetri tasemeni, võimaldades jälgida viiruseid. Ülikõrge mikroskoopiline pilditehnoloogia parandab mikroskoobi eraldusvõimet 200 nanomeetrilt kümnete nanomeetriteni, võimaldades jälgida elusrakkude organellide.
Eraldusvõime paranemine toob kaasa ka uusi probleeme ehk vaatevälja ja teravussügavuse vähenemist. Tavalise keskvalgustuse meetodi (fotoopilise valgustuse meetod, mis paneb valguse proovi ühtlaselt läbima) kasutamisel on mikroskoobi eraldusvõime kaugus d=0,61 λ/NA, nähtava valguse lainepikkuste vahemik on { {2}}nm, keskmine lainepikkus on 550 nm ja lainepikkus on fikseeritud konstant. Seetõttu võib NA väärtuse suurendamine saada väiksema D väärtuse, st vahemaa kahe punkti vahel, mida saab eristada Väiksem, võimaldades inimestel näha väiksemaid objekte selgelt.
NA väärtus on arvuline ava, mis kirjeldab objektiivi valgust vastuvõtva koonuse nurga suurust NA=n * sin , st läätse ja läätse vahelise keskkonna murdumisnäitaja (n) korrutis. kontrollitav objekt ja avanurga poole siinus (2 ). n on objektiivi ja proovi vahelise keskkonna valguse murdumisnäitaja. Kui mikroskoobi objekti ruumikeskkonnaks on õhk, on murdumisnäitaja n=1. Õhust kõrgema murdumisnäitaja kasutamine võib NA väärtust oluliselt suurendada. Veekümbluskeskkond on destilleeritud vesi ja murdumisnäitaja Suhe on 1,33; õlikümblusobjektiivi keskkond on seedriõli või muud läbipaistvad õlid ja selle murdumisnäitaja on üldiselt umbes 1,52, mis on läätse ja klaasklaasi murdumisnäitaja lähedal. Seetõttu on õliläätse NA väärtus kõrgem kui õhkläätse oma.
Avanurk, tuntud ka kui "peegli suunurk", on nurk, mille moodustavad objektiivi optilise telje objekti punkt ja objektiivi eesmise läätse efektiivne läbimõõt. Peegli suunurga suurendamine võib suurendada siinusväärtust ja selle tegelik ülempiir on umbes 72 kraadi (siinusväärtus on 0,95), korrutades seedriõli murdumisnäitaja 1,52-ga, võib saada, et maksimaalne NA väärtus on umbes 1,45 ja asendades eraldusvõime arvutamise valemiga, võib saada, et tavapärase mikroskoobi piirresolutsioon XY tasapinnal on umbes 0,2 um.
NA väärtus mõjutab otseselt ka mikroskoobi vaatevälja heledust (B). Valemist B∝NA2/M2 saame järeldada, et heledus suureneb koos numbrilise ava suurenemisega (NA) või objektiiviläätse suurenduse vähenemisega (M).
Teoreetiliselt peaksime püüdlema kõrgeima võimaliku NA väärtuse poole, et saada paremat XY tasapinna eraldusvõimet ja vaatevälja heledust. Igal asjal on aga kaks poolt. XY tasapinna eraldusvõime parandamine vähendab Z-telje teravussügavust ja vaatlusvälja.
Mikroskoobid vaatavad vaadet üldiselt vertikaalselt allapoole. Kui kumer asend ja nõgus asend objekti pinnal, mida vaadeldakse vaatevälja läbimõõdus, on selgelt näha, siis kumera punkti ja nõgusa punkti kõrguste erinevus on teravussügavus. Noh, mikroskoopide puhul, mida suurem on teravussügavus, seda parem. Mida suurem on teravussügavus, seda parema ja kolmemõõtmelisema selgusega pilte saab ebatasaste objektide pinda vaadeldes. Suur teravussügavus aitab meil vaadelda mikroskoopilist maailma vertikaalsuunas. See tähendab, Z-telje teave XYZ kolmemõõtmelisel kujul.
Teravussügavus on esi- ja tagaruumi sügavus, mis vastab selgele kujutisele pilditasandil: dtot=(λ*n)/NA pluss n/(M∗NA) * e, dtot: teravussügavus , NA: numbriline ava, M: kogusuurendus, λ: valguse lainepikkus, (tavaliselt λ=0,55 um), n: proovi ja objektiiviläätse vahelise keskkonna murdumisnäitaja (õhk: n{{3 }}, õli: n=1.52) Selle valemi järgi saame teada, et Z-telje teravussügavus on pöördvõrdeline XY tasapinna NA väärtusega.
Lisaks teravussügavusele mõjutab vaatevälja ka NA väärtus. Ruumiline vahemik, mida saab näha, kui seade vaatab punkti paigal, on vaateväli. Selle arvutamine on otseselt seotud objektiivi suurendusega. Vaatlemisel nähtav vaatevälja tegelik läbimõõt on võrdne vaatevälja läbimõõduga Jagatuna objektiiviläätse suurendusega, näitab okulaar vastavat vaatevälja, näiteks 10/18, st. suurendus on 10 korda ja vaatevälja läbimõõt on 18 mm. Seega, kui okulaar määratakse, siis mida suurem on suurendus, seda väiksem on vaadeldav vaateväli.
XY tasapinna eraldusvõime on kohalike detailide analüüs ja vaateväli määrab meie proovi vaatlusvahemiku. Mida suurem on vaateväli, seda parem, kuid praeguse tehnoloogiaga piiratud, peame heade NA väärtuste saamiseks kasutama suure võimsusega objektiivläätsi, seetõttu on nägemisvälja ja NA väärtustel kaudne negatiivne korrelatsioon.
