Fluorestsents-sisemise täieliku peegelduse fluorestsentsmikroskoopia rakendamine
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope), sisemise täieliku peegelduse fluorestsentsmikroskoop, kui valgus siseneb kõrge murdumisnäitajaga keskkonnast madalama murdumisnäitajaga keskkonda, kui langemisnurk on piisavalt suur, peegeldub kogu valgus ilma murdumiseta, kuid kahe meediumi liides tekitab kaduvaid laineid, mis võivad ergutada fluorestsentsi 100 nm piires liidese lähedal, et teostada objekti pinna jälgimist. Ergastusvalgust saab saata läbi tavapärase fluorestsentsmikroskoobi illuminaatori või spetsiaalse illuminaatori ning juhtida laseri langemisnurka. Ergastusvalguse detektorisse sisenemise vältimiseks kasutatakse hetkelise välja ergastamise meetodit. Ergastusvalgus klaasi ja vee liidesel tekitab täieliku sisemise peegelduse. Ergastusvalguse eksponentsiaalse nõrgenemise tõttu tekitab ainult kogu peegelduspinnale väga lähedal olev prooviala fluorestsentspeegeldust, mis vähendab oluliselt taustvalguse müra häireid vaatlusobjektile, mistõttu seda tehnoloogiat kasutatakse dünaamilises vaatluses laialdaselt. rakupinna ainetest.
Sisemise täieliku peegelduse fluorestsentsmikroskoopia (TIRFM) skemaatiline diagramm
①Näidis ②Kaolev laineulatus ③Kateklaas ④Õliimmersioon ⑤Sihtmärk ⑥Emissioonikiir (signaal) ⑦Ergastuskiir
Täieliku sisemise peegelduse saavutamiseks on vaja suurt langemisnurka, näiteks klaasi-vee liidese langemisnurk on suurem kui 61 kraadi. Seda saab saavutada prismaga, mida nimetatakse prismapõhiseks TIRFM-iks, või suure numbrilise avaga objektiivi abil, mida nimetatakse objektiivi tüüpi TIRFM-iks. Praegused müügil olevad sisemise täieliku peegelduse fluorestsentsmikroskoobid on üldiselt objektiivi tüüpi, suure kiirusega ja suure täpsusega.
Sisemise täieliku peegelduse fluorestsentsmikroskoopiat kasutatakse laialdaselt mõnes bioloogilises väljas, kuna see võimaldab objektide pinnal teostada fluorestsentsvaatlust väga õhukeses vahemikus (alla 100 nm). Näiteks järgmised rakendused:
Rakupinna kujutiste vaatlemine: rakumembraani pinna struktuur, rakupinna kontakt, membraanipinna dünaamika/valgu lokaliseerimine.
Ühemolekuliline vaatlus ja manipuleerimine: müosiin, aktiin ja Cy{1}}märgistatud ATP.
Rakumembraani pinna liikumine: näiteks vesiikulite neeldumine, vesiikulite väljahingamine ja vesiikulite eksokriin. a
Kaltsiumi sädemete nähtuse jälgimine rakumembraanis, ioonikanalite jälgimine.
Molekulaarmotoorika uuringud: pöörlemismootorid, tsütoskeleti valgud, polümeerid, G-valgud, ringvalgud, nukleotiidmootorid.
Lisaks bioloogia valdkonnale on sellel häid rakendusi ka keemia valdkonnas keemiliste molekulaarstruktuuride vaatlemiseks.
