Mitmete ülilahutusvõimega mikroskoopiatehnikate ülevaade
Tavalise valgusmikroskoopia puhul piirab valguse difraktsioon kujutise eraldusvõimet ligikaudu 250 nm-ni. Tänapäeval suudavad ülieraldusvõimega tehnikad seda parandada rohkem kui 10 korda. Seda tehnikat saavutatakse peamiselt kolme meetodi abil: ühemolekuliline lokaliseerimismikroskoopia, sealhulgas valgustundlik lokaliseerimismikroskoopia (PALM) ja stohhastiline optiline rekonstruktsioonmikroskoopia (STORM); struktureeritud valgustusmikroskoopia (SIM); ja stimuleeritud emissiooni ammendumise mikroskoopia (STED). Igaüks hoolib sellest, kuidas valida ülilahutusega tehnoloogiat. "Kahjuks puuduvad lihtsad põhimõtted, mille alusel otsustada, millist meetodit kasutada," ütleb Ühendkuningriigi Oxfordi ülikooli järeldoktor Mathew Stracy. "Igaühel neist on oma eelised ja puudused." Teadlased mõtlevad loomulikult ka välja, kuidas valida konkreetse projekti jaoks õige meetod. "Biopildistamise kontekstis on peamised tegurid, mida tuleb arvesse võtta, järgmised: ruumiline ja ajaline eraldusvõime, tundlikkus fotokahjustuste suhtes, märgistamisvõime, proovi paksus ja taustafluorestsents või raku autoloogne fluorestsents." Kuidas see töötab Erinevad ülilahutusega mikroskoobid töötavad erineval viisil. PALM-i ja STORM-i puhul on antud hetkel ergastatud või fotoaktiveeritud vaid väike osa fluorestseeruvatest markeritest, mis võimaldab nende iseseisvat lokaliseerimist suure täpsusega. Selle protsessi läbimine kõigi fluorestseeruvate märgistega annab täieliku ülieraldusvõimega pildi. Stefan Hell, üks 2014. aasta Nobeli keemiaauhinna laureaatidest ja Max Plancki Biofüüsikalise Keemia Instituudi direktor, ütles: "Süsteemi PALM/STORM on suhteliselt lihtne seadistada, kuid seda on raske rakendada, kuna fluorestsentslamp grupil peab olema fotoaktiveerimisvõime. Piirangud Puuduseks on see, et nad peavad tuvastama ühe fluorestseeruva molekuli raku kontekstis ja on vähem usaldusväärsed kui STED." STED kasutab fluorofoori ergastamiseks laserimpulssi ja fluorofoori kustutamiseks rõngakujulist laserit, jättes üliresolutsiooniks ainult nanomeetri suuruse fluorestsentsi. Kogu proovi skannimisel saadakse pilt. "STED-i eeliseks on see, et see on nuppude tehnoloogia," selgitas Hell. "See töötab nagu tavaline konfokaalne fluorestsentsmikroskoop." Samuti võib see pildistada elusrakke, kasutades fluorofoore, nagu rohelised või kollased fluorestseeruvad valgud ja rodamiinist saadud värvained. Parameetrite võrdlus Kuigi kõik ülilahutusvõimega tehnikad ületavad lahutusvõime poolest tavapärast valgusmikroskoopiat, erinevad need üksteisest. SIM kahekordistab eraldusvõime ligikaudu 100 nm-ni. PALM ja STORM suudavad lahendada 15 nm sihtmärke. Helli sõnul pakub STED ruumilist eraldusvõimet elusrakkudes 30 nm ja fikseeritud rakkudes 15 nm. Konkreetsete rakenduste puhul peame arvestama ka signaali-müra suhet. Mõnel juhul võib madalam eraldusvõime, kuid kõrgem SNR anda parema pildi kui vastupidine (kõrgem eraldusvõime, kuid madalam SNR). Väga oluline on ka pildi omandamise kiirus, eriti elusrakkude puhul. "Kõik ülieraldusvõimega tehnikad on aeglasemad kui tavalised fluorestsentspilditehnikad," ütles Stracy. "PALM/STORM on kõige aeglasem, see vajab ühe pildi saamiseks kümneid tuhandeid kaadreid, SIM vajab kümneid kaadreid ja STED on skaneerimistehnoloogia, nii et saamise kiirus sõltub vaatevälja suurusest." Lisaks elusrakkudele või fikseeritud pildistamisrakkudele tahavad mõned teadlased mõista ka seda, kuidas objektid liiguvad. Stracy on huvitatud elusrakkude bioloogiliste süsteemide dünaamika mõistmisest, mitte ainult staatilistest piltidest. Ta ühendab PALM-i üksikute osakeste jälgimisega, et analüüsida elusrakkude dünaamikat. Sel viisil saab ta markermolekule otse jälgida, kui nad oma funktsioone täidavad. Samas usub ta, et SIM ei sobi nende dünaamiliste protsesside uurimiseks molekulaarsel tasemel, kuid oma kiire omanduskiiruse tõttu sobib see eriti hästi suuremate struktuuride, näiteks tervete kromosoomide dünaamika vaatlemiseks. Viimased tulemused 2017. aastal teatas Helli meeskond ajakirjas Science MINFLUX ülieraldusvõimega mikroskoobist. Helli sõnul saavutab see ülieraldusvõime meetod esmakordselt 1 nm ruumilise eraldusvõime. Lisaks suudab see jälgida elusrakkude üksikuid molekule vähemalt 100 korda kiiremini kui teised meetodid. Ka teised teadlased rääkisid mikroskoobist MINFLUX väga hästi. "Pidevalt töötatakse välja uusi rakendusi ja lähenemisviise, kuid mulle paistavad silma kaks edusamme," ütles Shechtman. Üks on MINFLUX. "See kasutab geniaalset lähenemist väga täpse molekulaarse positsioneerimise saamiseks." Seoses teise põneva arenguga mainis Shechtman WE Moernerit ja tema kolleege Stanfordi ülikoolist. Moerner oli ka 2014. aasta Nobeli keemiaauhinna saaja. Üks võitjatest. Fluorestseeruvate üksikute molekulide anisotroopsest hajumisest põhjustatud kujutise eraldusvõime piirangute lahendamiseks kasutasid teadlased molekulide orientatsiooni ja asukoha määramiseks erinevaid ergastuspolarisatsioone. Lisaks on neil välja arenenud õrnad pupillide pinnad. Need tehnikad parandavad struktuuride lokaliseerimise võimet. Teave fluorestseeruvate siltide kohta Paljudes ülieraldusvõimega rakendustes on sildid tõesti olulised. On ka ettevõtteid, mis pakuvad seotud tooteid. Näiteks Saksamaa Miltenyi on teinud koostööd Stefan Helli asutatud ettevõttega Abberior, et pakkuda ülilahutusvõimega mikroskoopiavärvide jaoks kohandatud antikehade konjugatsiooniteenuseid. Mitmed teised ettevõtted pakuvad ka sobivaid markereid. "Meie nanovõimendid on väga väikesed, vaid 1,5 kDa ja väga spetsiifilised," ütleb ChromoTeki turundusametnik Christoph Eckert. Need valgud seovad rohelisi ja punaseid fluorestseeruvaid valke (GFP ja RFP). Need on saadud alpaka antikehade fragmentidest, mida tuntakse kui VHH või nanokehasid, millel on suurepärased seondumisomadused ja stabiilne kvaliteet ilma partiide kaupa varieerumata. Need markerid sobivad erinevate ülieraldusvõimega tehnikate jaoks, sealhulgas SIM, PALM, STORM ja STED. Marylandi ülikooli meditsiinikooli dotsent Ai-Hui Tang ja kolleegid kasutasid ChromoTeki GFP-Boosterit ja STORM-i, et uurida närvisüsteemis teabe levikut. Nad leidsid presünaptilistest ja postsünaptilistest neuronitest molekulaarseid nanoklastreid, mida nimetatakse nanokolonniteks. Teadlased usuvad, et see struktuur näitab, et kesknärvisüsteem kasutab sünaptilise efektiivsuse säilitamiseks ja reguleerimiseks lihtsaid põhimõtteid. Ülieraldusvõimega pildistamise erinevad versioonid ja üha suurem hulk meetodeid viivad teadlased veelgi sügavamale bioloogilistesse saladustesse. Läbides nähtava valguse difraktsioonipiiri, saavad bioloogid rakkude tegevust isegi "tähedalt jälgida".
